| 查看: 4144 | 回复: 11 | |||
[求助]
3个片段的重叠pcr能否一步到位？
|
|
有三个片段，分别为330 150 250bp，两个接头都有20bp的重叠序列，想一次性拼起来。PCR时分步进行，先是不加引物，单纯扩模板。希望得到三个片段正确连接的模板。然后加入第一个片段的上游引物和第三个片段的下游引物，做了好几次了，之前都会出现250bp的条带，又一次在目的条带大小处有点模糊的亮区，但是比250bp处的条带暗很多。最后一次什么条带都没了。 拼模板时的退火温度试过55至40℃的梯度，和40到30℃的touchdown，都是10个循环，后面加入引物的扩增试过50-68℃的梯度，都没有能成功。我自己觉得问题主要处在3片段的模板没有连出来。不知道有没有人遇到过类似的情况？该怎么解决？ 关于出现250bp的非目的条带，怀疑是单引物扩增，引物第三个片段刚好也是250bp的样子。不知道这种情况在不跟换引物的前提下还能不能做下去？ |
回复此楼» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有132人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
嵌套PCR引物如何设计？目的片段434bp
已经有6人回复- 重叠延伸PCR引物合成求助
已经有15人回复
- 醛转化成氰基 能一步到位吗
已经有3人回复
- 大片段PCR扩增求助
已经有34人回复
- 高GC含量基因片段PCR问题
已经有13人回复
- 重叠PCR应该怎么做？
已经有9人回复
- 基因组中长片段PCR应该注意的几个问题
已经有14人回复
- 重叠PCR克隆大片段
已经有4人回复
- 重叠pcr\跳跃pcr的问题
已经有14人回复
- 如何设计重叠延伸PCR引物
已经有14人回复
- 【求助/交流】长片段PCR
已经有10人回复
- 【求助/交流】重叠PCR相关问题。
已经有8人回复
- 【求助/交流】5500bp的片段PCR问题
已经有21人回复
2楼2012-04-16 09:19:50
3楼2012-04-16 17:25:41
4楼2012-04-16 19:15:56
5楼2012-04-16 20:33:40
西瓜
荣誉版主 (知名作家)
- MolEPI: 50
- 应助: 94 (初中生)
- 贵宾: 3.157
- 金币: 1849.6
- 散金: 11458
- 红花: 116
- 沙发: 21
- 帖子: 7553
- 在线: 1449.5小时
- 虫号: 271749
- 注册: 2006-08-13
- 性别: GG
- 专业: 细胞衰老
- 管辖: 分子生物
6楼2012-04-16 21:34:55
7楼2012-04-16 22:27:58
8楼2012-04-16 23:05:18
9楼2012-04-16 23:06:20
chibang1220
木虫 (著名写手)
- 应助: 42 (小学生)
- 金币: 5697.7
- 散金: 68
- 红花: 8
- 帖子: 1435
- 在线: 333.1小时
- 虫号: 1653055
- 注册: 2012-02-29
- 性别: GG
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
10楼2012-04-17 10:38:34