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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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zhghlj

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
是不是也要换一下适合长片段PCR使用的酶呢?

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

11楼2014-06-03 10:18:53
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王小七wq

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-06-04 19:56:51
我之前也扩增2kd左右片段,退火温度55度,90s,也可适当的提高温度至58度,90s,25或30个循环,别的条件和你基本一致,扩增出目的条带。如果条件许可,你可以换聚合酶,phusion甚至是Q5。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

12楼2014-06-03 15:47:44
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hailey

银虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 王小七wq at 2014-06-03 15:47:44
我之前也扩增2kd左右片段,退火温度55度,90s,也可适当的提高温度至58度,90s,25或30个循环,别的条件和你基本一致,扩增出目的条带。如果条件许可,你可以换聚合酶,phusion甚至是Q5。

嗯嗯。。。好,我计划试试,同学能说的详细点吗,急求!
时刻为梦想而战!!
13楼2014-06-03 19:19:08
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hailey

银虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by zhghlj at 2014-06-03 10:18:53
是不是也要换一下适合长片段PCR使用的酶呢?

嗯嗯。。。准备换一下酶。。
时刻为梦想而战!!
14楼2014-06-03 19:20:01
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hailey

银虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by zhghlj at 2014-06-03 10:18:53
是不是也要换一下适合长片段PCR使用的酶呢?

嗯嗯…  准备换一下酶

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
时刻为梦想而战!!
15楼2014-06-04 14:55:26
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hailey

银虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
12楼: Originally posted by 王小七wq at 2014-06-03 15:47:44
我之前也扩增2kd左右片段,退火温度55度,90s,也可适当的提高温度至58度,90s,25或30个循环,别的条件和你基本一致,扩增出目的条带。如果条件许可,你可以换聚合酶,phusion甚至是Q5。

谢谢…   准备试试

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
时刻为梦想而战!!
16楼2014-06-04 14:56:20
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cuiyangyan

新虫 (初入文坛)

亲,可以分段PCR,再连起来。
用每一次的尝试填满命运的空缺
17楼2014-06-04 16:45:55
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20140427

铜虫 (初入文坛)

别用全式金的,做的不好。

[ 发自小木虫客户端 ]
18楼2014-06-04 17:26:49
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王小七wq

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
13楼: Originally posted by hailey at 2014-06-03 19:19:08
嗯嗯。。。好,我计划试试,同学能说的详细点吗,急求!...

不好意思,我看错了,但愿你没按我说的90s做,要不我就罪过大了。应该是30s,我之前用taq酶pcr时,(ddw32ul;5xHF buffer 10ul;dntp 2ul;primer mix 2ul;模版5ul)
98度,2min;
98度30s;
退火温度55度,30s;
72度,1min;
72度,5min.
18个循环

也用过Q5,体系50ul,(ddw35ul;q5反应液10ul;dntp1ul;primer mix2ul;模版1.5ul;q5酶0.5ul);
预变性98度30s;
变形98度15s;
复性55度20s;
延伸72度150s;
再延伸72度5min.
20个循环
19楼2014-06-06 17:37:43
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王小七wq

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
13楼: Originally posted by hailey at 2014-06-03 19:19:08
嗯嗯。。。好,我计划试试,同学能说的详细点吗,急求!...

用taq酶的,体系50ul(ddw 32ul; 5x hf buffer 10ul;dntp 2ul; primer mix 2ul;模版5ul;酶0.5ul)
98度,2min ;
98度,30s;
55度,30s;
72度,1min;
72度,5min;
4度,forever.
18个循环。这是我之前做的记录,仅供参考。
用taq酶扩增时,退火温度可以适当的提高,我做过58度;延伸时间可以适当增长,我做过150s。之前说的90s,不好意思,我记混了,但愿你没有照着做,要不我就罪过大了

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

20楼2014-06-06 18:16:34
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