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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 2.3kb 大片段pcr 求赐教
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zhghlj

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是也要换一下适合长片段PCR使用的酶呢？
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hailey hailey
11楼2014-06-03 10:18:53
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王小七wq

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-06-04 19:56:51
我之前也扩增2kd左右片段，退火温度55度，90s，也可适当的提高温度至58度，90s，25或30个循环，别的条件和你基本一致，扩增出目的条带。如果条件许可，你可以换聚合酶，phusion甚至是Q5。
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hailey
12楼2014-06-03 15:47:44
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hailey

银虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 王小七wq at 2014-06-03 15:47:44
我之前也扩增2kd左右片段，退火温度55度，90s，也可适当的提高温度至58度，90s，25或30个循环，别的条件和你基本一致，扩增出目的条带。如果条件许可，你可以换聚合酶，phusion甚至是Q5。

嗯嗯。。。好，我计划试试，同学能说的详细点吗，急求！
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时刻为梦想而战！！
13楼2014-06-03 19:19:08
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hailey

银虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by zhghlj at 2014-06-03 10:18:53
是不是也要换一下适合长片段PCR使用的酶呢？

嗯嗯。。。准备换一下酶。。
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时刻为梦想而战！！
14楼2014-06-03 19:20:01
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hailey

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by zhghlj at 2014-06-03 10:18:53
是不是也要换一下适合长片段PCR使用的酶呢？

嗯嗯…  准备换一下酶

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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时刻为梦想而战！！
15楼2014-06-04 14:55:26
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hailey

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
12楼: Originally posted by 王小七wq at 2014-06-03 15:47:44
我之前也扩增2kd左右片段，退火温度55度，90s，也可适当的提高温度至58度，90s，25或30个循环，别的条件和你基本一致，扩增出目的条带。如果条件许可，你可以换聚合酶，phusion甚至是Q5。

谢谢…   准备试试

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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时刻为梦想而战！！
16楼2014-06-04 14:56:20
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cuiyangyan

新虫 (初入文坛)
亲，可以分段PCR，再连起来。
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用每一次的尝试填满命运的空缺
17楼2014-06-04 16:45:55
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20140427

铜虫 (初入文坛)
别用全式金的，做的不好。

[ 发自小木虫客户端 ]
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18楼2014-06-04 17:26:49
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王小七wq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by hailey at 2014-06-03 19:19:08
嗯嗯。。。好，我计划试试，同学能说的详细点吗，急求！...

不好意思，我看错了，但愿你没按我说的90s做，要不我就罪过大了。应该是30s,我之前用taq酶pcr时，(ddw32ul;5xHF buffer 10ul;dntp 2ul;primer mix 2ul;模版5ul)
98度，2min;
98度30s;
退火温度55度，30s;
72度，1min;
72度，5min.
18个循环

也用过Q5，体系50ul,(ddw35ul;q5反应液10ul;dntp1ul;primer mix2ul;模版1.5ul;q5酶0.5ul);
预变性98度30s；
变形98度15s;
复性55度20s；
延伸72度150s;
再延伸72度5min.
20个循环
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19楼2014-06-06 17:37:43
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王小七wq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by hailey at 2014-06-03 19:19:08
嗯嗯。。。好，我计划试试，同学能说的详细点吗，急求！...

用taq酶的，体系50ul（ddw 32ul; 5x hf buffer 10ul;dntp 2ul; primer mix 2ul;模版5ul;酶0.5ul)
98度，2min ;
98度，30s;
55度，30s;
72度，1min;
72度,5min;
4度，forever.
18个循环。这是我之前做的记录，仅供参考。
用taq酶扩增时，退火温度可以适当的提高，我做过58度；延伸时间可以适当增长，我做过150s。之前说的90s，不好意思，我记混了，但愿你没有照着做，要不我就罪过大了
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hailey
20楼2014-06-06 18:16:34
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