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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 2.3kb 大片段pcr 求赐教
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hailey

银虫 (小有名气)

[求助] 2.3kb 大片段pcr 求赐教 已有4人参与

请路过的虫友大神们看看，我的片段是2.3kb的，GC 含量是59.61%  ，所以就没用GC buffer 。
所用PCR体系25ul  ,
10*transtart buffer 2.5ul
transtart Taq  ase    0.5ul
dNTPs  1ul
primer1  1ul
primer    1ul
cDNA   2ul
dd 水  17ul  

95度 5min
94度 30s
51度 -61度  设置梯度 各30s
72度 2.5min
72度 10min
35个循环

没有P出来目的条带，什么都没有，本想上传图片的，网络不好没有上传成功

求赐教
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时刻为梦想而战！！
1楼 2014-06-02 00:19:02
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hailey

银虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 王小七wq at 2014-06-03 15:47:44
我之前也扩增2kd左右片段，退火温度55度，90s，也可适当的提高温度至58度，90s，25或30个循环，别的条件和你基本一致，扩增出目的条带。如果条件许可，你可以换聚合酶，phusion甚至是Q5。

嗯嗯。。。好，我计划试试，同学能说的详细点吗，急求！
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时刻为梦想而战！！
13楼2014-06-03 19:19:08
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BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-02 10:49:45
换cDNA模板。
2.3k不大，cDNA模板质粒不高通常是P不出来的原因。另外，cDNA是有组织特异性的，你的基因确定在这个组织或细胞系中有比较高的表达？
赞一下 回复此楼
2楼2014-06-02 07:34:15
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hailey

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by BioChen at 2014-06-02 07:34:15
换cDNA模板。
2.3k不大，cDNA模板质粒不高通常是P不出来的原因。另外，cDNA是有组织特异性的，你的基因确定在这个组织或细胞系中有比较高的表达？

嗯嗯。。。是有高表达的，可以查到相关文献的，今天准备加10* GC  enhanger 试试..
赞一下 回复此楼
时刻为梦想而战！！
3楼2014-06-02 09:12:30
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BioChen

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hailey at 2014-06-02 09:12:30
嗯嗯。。。是有高表达的，可以查到相关文献的，今天准备加10* GC  enhanger 试试.....

之前的回答，打错字了，囧
是cDNA质量不高
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4楼2014-06-02 09:19:40
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