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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 2.3kb 大片段pcr 求赐教
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hailunl

金虫 (正式写手)
延伸时间过长，造成PCR时间过长。酶活性降低。
建议高保真快酶。
KOD fx neo.
引物23左右个碱基，减少非特异性。
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21楼2014-06-06 20:10:23
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hailey

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by zhghlj at 2014-06-03 10:18:53
是不是也要换一下适合长片段PCR使用的酶呢？

同实验室的师姐P过3kb的，人家用的普通酶就P出来了，然后只是用高保真酶来减少他的突变率，但是我P的目的条带根本就没有出来呢，所以感觉即使换了高保真酶也不一定出结果
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时刻为梦想而战！！
22楼2014-06-07 19:45:44
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hailey

银虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 20140427 at 2014-06-04 17:26:49
别用全式金的，做的不好。

什么意思。。
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时刻为梦想而战！！
23楼2014-06-07 19:46:31
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hailey

银虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by 王小七wq at 2014-06-06 17:37:43
不好意思，我看错了，但愿你没按我说的90s做，要不我就罪过大了。应该是30s,我之前用taq酶pcr时，(ddw32ul;5xHF buffer 10ul;dntp 2ul;primer mix 2ul;模版5ul)
98度，2min;
98度30s;
退火温度55度，30s;
72度 ...

嗯嗯。。。没有用那个体系，我只是加了1ul 的DMSO ,仍然木有目的基因，而且也用actin 验证了一下模板，actin 很正常就跑出来，条带很亮呢。
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时刻为梦想而战！！
24楼2014-06-07 19:50:04
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hailey

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
20楼: Originally posted by 王小七wq at 2014-06-06 18:16:34
用taq酶的，体系50ul（ddw 32ul; 5x hf buffer 10ul;dntp 2ul; primer mix 2ul;模版5ul;酶0.5ul)
98度，2min ;
98度，30s;
55度，30s;
72度，1min;
72度,5min;
4度，forever.
18个循环。这是我之前做的记录 ...

25楼2014-06-07 19:50:36
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hailey

银虫 (小有名气)
引用回帖:
21楼: Originally posted by hailunl at 2014-06-06 20:10:23
延伸时间过长，造成PCR时间过长。酶活性降低。
建议高保真快酶。
KOD fx neo.
引物23左右个碱基，减少非特异性。

同实验室的师姐P过3kb的，人家用的普通酶就P出来了，然后只是用高保真酶来减少他的突变率，但是我P的目的条带根本就没有出来呢，所以感觉即使换了高保真酶也不一定出结果
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26楼2014-06-07 19:51:42
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hailey

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-02 21:36:31
1.拿内参基因的引物扩增下看看你的cDNA质量咋样~
2.如果杂带太多那就是你的PCR条件不适合或者你设计的引物不好。

内参跑出来了，条带很清晰呢，能说明cDNA 质量很好吗？？
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时刻为梦想而战！！
27楼2014-06-07 20:55:12
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
27楼: Originally posted by hailey at 2014-06-07 20:55:12
内参跑出来了，条带很清晰呢，能说明cDNA 质量很好吗？？...

可以。
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大家相互帮助哈
28楼2014-06-07 23:09:43
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hailunl

金虫 (正式写手)
引用回帖:
26楼: Originally posted by hailey at 2014-06-07 19:51:42
同实验室的师姐P过3kb的，人家用的普通酶就P出来了，然后只是用高保真酶来减少他的突变率，但是我P的目的条带根本就没有出来呢，所以感觉即使换了高保真酶也不一定出结果...

好P的什么酶都可以P出来。
全世金，rTaq对复杂模板，长片段无能为力，
不好扩的基因必须要高效高保真的酶，虽然贵点。

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29楼2014-06-08 00:17:36
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hailey

银虫 (小有名气)
哦…   好吧，那我还是试试吧

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时刻为梦想而战！！
30楼2014-06-08 00:37:45
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