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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR 克隆 问题，小弟新手，求帮助。
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zlimba

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR 克隆 问题，小弟新手，求帮助。 已有3人参与

最近很不顺利，不知到底是哪儿出现了问题。

目的片段，1800-—2500bp     中间含有太多重复序列。

载体：PMD19-T

第一点、PCR扩增 ，  电泳回收 (试剂盒回收并电泳检测）
连接：DNA:7.7
          BUFFER:1
          T4酶：1
          pmd19-T：0.3             过夜16H左右。
转化：感受态是自己做的，涂板过夜培养一般长的很好，不知道是否代表感受态没有问题？
PCR阳性鉴定：r-taq酶，最近一直没有结果。
第二点、将PCR鉴定有阳性的用来提取质粒，做亚克隆，因为重复序列多，2000bp+的一般不容易测通。
双酶切之后电泳回收，条带明显存在梯度，是否代表这一步成功了。
然后，再一次连接
     DNA:8
     T4酶：1
     BUFFER:1
过夜16度  16H
转化也能长得很好，感受态还是用自己做的，但是阳性仍然没有。


途中曾经将未检测到阳性的 送到公司测序，显示空载。

所以我想是不是连接没有连接上？还是感受态问题？还是实验室药品有问题（大家阳性检测也很少很少，但我没有）？还是我以上步骤存在问题？特别是第二点亚克隆是否存在问题？
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1楼 2014-04-22 14:48:19
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猪尾巴草

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-04-22 23:15:03
1、我问一下，你第一步PCR出目的基因连接了，为何还要再酶切连接？
2、如果你想知道是不是感受态的问题，你可以导个空载体到感受态里和不导载体涂板看看
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2楼2014-04-22 19:49:51
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xygcdmr

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zlimba(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-04-23 12:06:15
电泳回收后要再跑个电泳看下条带亮度，确定回收成功，可以的话还可以测浓度，如果很亮，或者浓度高，连接的时候DNA就没必要加太多，可能2-3就可以，载体0.3有点少，10的体系，应该加1。
PCR阳性检测时，假阳性太高，退火温度要很高来减少假阳性才行，可以只比引物TM值低1-2度，提完质粒做酶切鉴定更可靠。送测序就OK了，一次成功，不用二次连接的。
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3楼2014-04-23 01:08:00
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xygcdmr

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-26 09:34:45
确定加对了抗生素，涂板长得很好，就不是感受态的问题，可以转一个对照质粒试试。一般质粒会长得密密麻麻。
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4楼2014-04-23 01:10:24
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zlimba

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 猪尾巴草 at 2014-04-22 19:49:51
1、我问一下，你第一步PCR出目的基因连接了，为何还要再酶切连接？
2、如果你想知道是不是感受态的问题，你可以导个空载体到感受态里和不导载体涂板看看

序列重复片段太多了，第一次阳性鉴定送样的话，测不通。所以又提质粒酶切成小一点的片段，这样更加准确。
不知道我说的对吗？我看以前的论文有这样的。
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5楼2014-04-23 10:35:43
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zlimba

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xygcdmr at 2014-04-23 01:08:00
电泳回收后要再跑个电泳看下条带亮度，确定回收成功，可以的话还可以测浓度，如果很亮，或者浓度高，连接的时候DNA就没必要加太多，可能2-3就可以，载体0.3有点少，10的体系，应该加1。
PCR阳性检测时，假阳性太高 ...

我直接送测序，回来不能拼接上。

现在用solution1载体加0.5  其他都是5 ，这个能行吗
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6楼2014-04-23 10:38:47
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xygcdmr

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-26 09:34:50
仔细拼接下，拼接不上应该就是没连接成功。送测序前可以用载体上的酶切位点做下酶切，酶切正确一般连接都会成功的。序列偏大，连接体系配置的时候要小心加样，4度过夜连接10-12小时效果会好些。PCR产物和载体摩尔比为1/2到2/1比较合适，连接前算下体系。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2014-04-23 13:58:05
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dizang2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-26 09:34:54
这个就太扯了，pmd19t做ta的话，a尾没加，然后链接体系不对：buffer看看是不是浓度正确的，takara的应该是2x的，还有takara的buffer里有链接酶的，不需要再加
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8楼2014-05-26 09:12:16
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