| 查看: 1188 | 回复: 7 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
PCR 克隆 问题，小弟新手，求帮助。已有3人参与
|
||
|
最近很不顺利，不知到底是哪儿出现了问题。 目的片段，1800-—2500bp 中间含有太多重复序列。 载体：PMD19-T 第一点、PCR扩增 ， 电泳回收 (试剂盒回收并电泳检测） 连接：DNA:7.7 BUFFER:1 T4酶：1 pmd19-T：0.3 过夜16H左右。 转化：感受态是自己做的，涂板过夜培养一般长的很好，不知道是否代表感受态没有问题？ PCR阳性鉴定：r-taq酶，最近一直没有结果。 第二点、将PCR鉴定有阳性的用来提取质粒，做亚克隆，因为重复序列多，2000bp+的一般不容易测通。 双酶切之后电泳回收，条带明显存在梯度，是否代表这一步成功了。 然后，再一次连接 DNA:8 T4酶：1 BUFFER:1 过夜16度 16H 转化也能长得很好，感受态还是用自己做的，但是阳性仍然没有。 途中曾经将未检测到阳性的 送到公司测序，显示空载。 所以我想是不是连接没有连接上？还是感受态问题？还是实验室药品有问题（大家阳性检测也很少很少，但我没有）？还是我以上步骤存在问题？特别是第二点亚克隆是否存在问题？ |
回复此楼» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有271人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
PCR产物做克隆，菌液涂平板后长得很慢是什么原因？
已经有17人回复- 关于设计克隆引物时产物片段大小有限制吗，如果我没有全长要怎么做能克隆到它的全长
已经有14人回复
- 大肠杆菌为模板，想P其中一段基因，是提取它的基因组再PCR还是直接菌液PCR？
已经有11人回复
- 急救！cDNA做模板进行PCR克隆出的质粒测出了一段内含子
已经有4人回复
- 挑取单克隆后的PCR验证
已经有3人回复
- 关于基因克隆的一些实验技术问题
已经有6人回复
- PCR产物不做纯化和胶回收，直接TA克隆可以吗？
已经有13人回复
- 已知基因序列，要用PCR克隆该基因，模板从哪里来？
已经有13人回复
- 求关于Overlap PCR(重叠延伸PCR)的具体实验过程及原理
已经有10人回复
- 关于克隆技术——pcr产物测序问题
已经有16人回复
- 挑单克隆后，菌液PCR检测所有条带都偏小，目的条带没有出现
已经有9人回复
- 最近做T克隆都是阴性，怎么回事？
已经有14人回复
- 求助具体的（具体的）无连接酶亚克隆法全步骤，从PCR到克隆
已经有13人回复
- 求助-基因克隆及引物设计的问题
已经有6人回复
- 求PCR实验流程，小弟是个新手求高手相助
已经有9人回复
- 求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法
已经有15人回复
- pcr，RACE,低表达量基因的克隆
已经有8人回复
- pcr产物测序和克隆之后重组质粒测序结果一样吗？
已经有12人回复
- 【求助/交流】PCR产物切胶回收后可不可以加A尾,做TA克隆，急！希望高手们能帮帮忙！
已经有9人回复
- 【求助/交流】进行pcr克隆时，出现拖尾现象
已经有6人回复
- 【求助/交流】从RNA到cDNA合成再到克隆PCR的实验技巧和操作细节问题若干，寻求解答
已经有12人回复
- 【求助/交流】PCR法克隆基因
已经有8人回复
5楼2014-04-23 10:35:43
2楼2014-04-22 19:49:51
xygcdmr
木虫 (小有名气)
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 2336.9
- 红花: 3
- 帖子: 176
- 在线: 47.9小时
- 虫号: 2524554
- 注册: 2013-06-28
- 性别: GG
- 专业: 植物生理与生化
3楼2014-04-23 01:08:00
xygcdmr
木虫 (小有名气)
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 2336.9
- 红花: 3
- 帖子: 176
- 在线: 47.9小时
- 虫号: 2524554
- 注册: 2013-06-28
- 性别: GG
- 专业: 植物生理与生化
4楼2014-04-23 01:10:24