应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR 克隆 问题，小弟新手，求帮助。
51/1返回列表
查看: 1361  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

zlimba

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR 克隆 问题，小弟新手，求帮助。 已有3人参与

最近很不顺利，不知到底是哪儿出现了问题。

目的片段，1800-—2500bp     中间含有太多重复序列。

载体：PMD19-T

第一点、PCR扩增 ，  电泳回收 (试剂盒回收并电泳检测）
连接：DNA:7.7
          BUFFER:1
          T4酶：1
          pmd19-T：0.3             过夜16H左右。
转化：感受态是自己做的，涂板过夜培养一般长的很好，不知道是否代表感受态没有问题？
PCR阳性鉴定：r-taq酶，最近一直没有结果。
第二点、将PCR鉴定有阳性的用来提取质粒，做亚克隆，因为重复序列多，2000bp+的一般不容易测通。
双酶切之后电泳回收，条带明显存在梯度，是否代表这一步成功了。
然后，再一次连接
     DNA:8
     T4酶：1
     BUFFER:1
过夜16度  16H
转化也能长得很好，感受态还是用自己做的，但是阳性仍然没有。


途中曾经将未检测到阳性的 送到公司测序，显示空载。

所以我想是不是连接没有连接上？还是感受态问题？还是实验室药品有问题（大家阳性检测也很少很少，但我没有）？还是我以上步骤存在问题？特别是第二点亚克隆是否存在问题？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-04-22 14:48:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xygcdmr

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-26 09:34:45
确定加对了抗生素，涂板长得很好，就不是感受态的问题，可以转一个对照质粒试试。一般质粒会长得密密麻麻。
赞一下 回复此楼
4楼2014-04-23 01:10:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答

猪尾巴草

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-04-22 23:15:03
1、我问一下，你第一步PCR出目的基因连接了，为何还要再酶切连接？
2、如果你想知道是不是感受态的问题，你可以导个空载体到感受态里和不导载体涂板看看
赞一下 回复此楼
2楼2014-04-22 19:49:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xygcdmr

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zlimba(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-04-23 12:06:15
电泳回收后要再跑个电泳看下条带亮度，确定回收成功，可以的话还可以测浓度，如果很亮，或者浓度高，连接的时候DNA就没必要加太多，可能2-3就可以，载体0.3有点少，10的体系，应该加1。
PCR阳性检测时，假阳性太高，退火温度要很高来减少假阳性才行，可以只比引物TM值低1-2度，提完质粒做酶切鉴定更可靠。送测序就OK了，一次成功，不用二次连接的。
赞一下 回复此楼
3楼2014-04-23 01:08:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zlimba

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 猪尾巴草 at 2014-04-22 19:49:51
1、我问一下，你第一步PCR出目的基因连接了，为何还要再酶切连接？
2、如果你想知道是不是感受态的问题，你可以导个空载体到感受态里和不导载体涂板看看

序列重复片段太多了，第一次阳性鉴定送样的话，测不通。所以又提质粒酶切成小一点的片段，这样更加准确。
不知道我说的对吗？我看以前的论文有这样的。
赞一下 回复此楼
5楼2014-04-23 10:35:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿上海交大生物与医药专硕324分，求调剂 +4 jiajunX 2026-03-22 4/200 2026-03-23 14:21 by xiaotangjing
[考研] 工科0856求调剂 +4 沐析汀汀 2026-03-21 4/200 2026-03-23 13:08 by 醉在风里
[考研] 08工学调剂 +6 用户573181 2026-03-20 10/500 2026-03-23 11:04 by 用户573181
[考研] 考研化学308分求调剂 +5 你好明天你好 2026-03-23 6/300 2026-03-23 11:02 by 素颜倾城1988
[考研] 328求调剂，英语六级551，有科研经历 +6 生物工程调剂 2026-03-17 10/500 2026-03-22 20:22 by edmund7
[考研] 311求调剂 +6 冬十三 2026-03-18 6/300 2026-03-22 20:18 by edmund7
[考研] 315分，诚求调剂，材料与化工085600 +3 13756423260 2026-03-22 3/150 2026-03-22 20:11 by edmund7
[考研] 289求调剂 +7 怀瑾握瑜l 2026-03-20 7/350 2026-03-22 15:57 by ColorlessPI
[考研] 285求调剂 +6 ytter 2026-03-22 6/300 2026-03-22 12:09 by 星空星月
[考研] 一志愿深大，0703化学，总分302，求调剂 +4 七月-七七 2026-03-21 4/200 2026-03-21 18:20 by 学员8dgXkO
[考研] 307求调剂 +3 余意卿 2026-03-18 3/150 2026-03-21 17:31 by ColorlessPI
[考研] 求调剂 +3 白QF 2026-03-21 3/150 2026-03-21 13:12 by zhukairuo
[考研] 332求调剂 +3 凤凰院丁真 2026-03-20 3/150 2026-03-21 10:27 by luoyongfeng
[考研] 求调剂 +6 Mqqqqqq 2026-03-19 6/300 2026-03-21 08:04 by JourneyLucky
[考研] 316求调剂 +6 梁茜雯 2026-03-19 6/300 2026-03-21 06:32 by Ecowxq666！
[考研] 317求调剂 +5 申子申申 2026-03-19 9/450 2026-03-20 22:26 by JourneyLucky
[考研] 086500 325 求调剂 +3 领带小熊 2026-03-19 3/150 2026-03-20 18:38 by 尽舜尧1
[考研] 288求调剂，一志愿华南理工大学071005 +5 ioodiiij 2026-03-17 5/250 2026-03-19 18:22 by zcl123
[考研] 286求调剂 +6 lemonzzn 2026-03-16 10/500 2026-03-19 14:31 by lemonzzn
[考研] 考研调剂 +3 淇ya_~ 2026-03-17 5/250 2026-03-17 09:25 by Winj1e
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭