应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于基因克隆的一些实验技术问题
71/1返回列表
查看: 1640  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

sars37

捐助贵宾 (小有名气)

[求助] 关于基因克隆的一些实验技术问题

小弟基因克隆新手，用的是限制性内切酶和连接，目前遇到两个问题，一个是用内切酶HindIII 和EcoRI 对有目的基因的质粒和PCDNA3.1酶切后，回收胶的回收率特别低，切完后看到的条带还很亮，回收后再电泳就很弱，测浓度发现只有10ng/ul左右，用的是QIAGEN的QIAEX II 试剂盒，小弟自己分析的原因是，50°水浴之后EP管里液体的颜色不够黄，也就是PH太高，没有调PH，还有一个就是在最后加水溶解DNA的时候水的PH偏酸，没有调到8.0。第二个问题是酶切的体系问题，含有目的基因的质粒酶切体系是10ul的Tvector，HindIII 和EcoRI各3ul，buffer4ul,共40ul体系，不知道PCDNA应该用什么样的体系，切多少，好像说连接的时候靶基因对质粒的摩尔数之比要在5-9:1，对这个概念我不是太懂。Tvector浓度是5.6ug/ul，纯化后的PCDNA浓度是0.86ug/ul。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-07-13 15:17:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sars37: 金币+7, ★★★★★最佳答案 2013-07-13 15:49:40
1. 产物回收后，不用测浓度，到时候连接时，往体系里面多加点片段

2. 你的酶切体系有问题，EcoRI和HindIII酶根本不用这么多
质粒 1ug
EcoRI 1ul
HindIII 1ul
Buffer  2ul
-----------------------------
补齐水到20ul

目的基因的T载体，可以多切些，但1ug也足够了

载体一定要少切，一般400ng足够了，20ul体系，要充分保证载体被酶切开
赞一下(1人) 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-07-13 15:27:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sars37

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-07-13 15:27:08
1. 产物回收后，不用测浓度，到时候连接时，往体系里面多加点片段

2. 你的酶切体系有问题，EcoRI和HindIII酶根本不用这么多
质粒 1ug
EcoRI 1ul
HindIII 1ul
Buffer  2ul
-----------------------------
补 ...

我的质粒浓度是5.6ug/ul，PCDNA的浓度是0.8ug/ul，也就是说把质粒稀释五倍后吸1ul酶切，PCDNA稀释两倍后吸1ul酶切吗？
赞一下 回复此楼
3楼2013-07-13 15:34:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
3楼: Originally posted by sars37 at 2013-07-13 15:34:20
我的质粒浓度是5.6ug/ul，PCDNA的浓度是0.8ug/ul，也就是说把质粒稀释五倍后吸1ul酶切，PCDNA稀释两倍后吸1ul酶切吗？...

是这样子的，一定要控制好酶切的DNA量
赞一下(1人) 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-07-13 15:35:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sars37

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2013-07-13 15:35:57
是这样子的，一定要控制好酶切的DNA量...

好的，谢谢，关于T4连接酶的一些问题可能还要麻烦你。。比如反应体系什么的。。不知道DNA片段和载体DNA的pmol如何换算。
赞一下 回复此楼
5楼2013-07-13 15:49:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
5楼: Originally posted by sars37 at 2013-07-13 15:49:21
好的，谢谢，关于T4连接酶的一些问题可能还要麻烦你。。比如反应体系什么的。。不知道DNA片段和载体DNA的pmol如何换算。...

我一般不考虑片段和载体的mol比等问题，但有一个原则就是尽量多的加你的片段和少加载体，体系一般用小体积连接，比如10ul，我3-15ul的体系都用过，你可以试试10ul体系

片段   若干，多加点
载体   400ng酶切回收20ul洗脱的话，加2ul足够了
10X T4 ligase buffer 1ul
Ligase   1ul
-----------------------------------
补水到10ul
赞一下(1人) 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2013-07-13 15:58:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sars37

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gyesang at 2013-07-13 15:58:39
我一般不考虑片段和载体的mol比等问题，但有一个原则就是尽量多的加你的片段和少加载体，体系一般用小体积连接，比如10ul，我3-15ul的体系都用过，你可以试试10ul体系

片段   若干，多加点
载体   400ng酶切回 ...

那个，我还想再问一下，用QIAEXII这个试剂盒回收胶，做胶的TBE要用1mM EDTA,ph8.0调PH值吗，TBE的PH值要调到多少呢？电泳液也要调吗？
赞一下 回复此楼
7楼2013-07-13 18:24:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 sars37 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料专硕326求调剂 +4 墨煜姒莘 2026-03-15 4/200 2026-03-15 11:02 by dyw
[考研] 211本，11408一志愿中科院277分，曾在中科院自动化所实习 +3 Losir 2026-03-12 3/150 2026-03-14 12:11 by 热情沙漠
[考研] 293求调剂 +5 上班不着吉 2026-03-09 5/250 2026-03-14 02:37 by JourneyLucky
[考研] 调剂 +3 13853210211 2026-03-10 3/150 2026-03-14 00:47 by JourneyLucky
[考研] 327求调剂 +4 Ffff03 2026-03-10 4/200 2026-03-14 00:17 by JourneyLucky
[考研] 341求调剂 +4 番茄头--- 2026-03-10 4/200 2026-03-13 23:12 by JourneyLucky
[考研] 求材料调剂 085600英一数二总分302 前三科235 精通机器学习 一志愿哈工大 +4 林yaxin 2026-03-12 4/200 2026-03-13 22:04 by 星空星月
[考研] 0856材料与化工301求调剂 +5 奕束光 2026-03-13 5/250 2026-03-13 22:00 by 星空星月
[考研] 304求调剂 +7 7712b 2026-03-13 7/350 2026-03-13 21:42 by peike
[考研] 0703化学一志愿211 总分320求调剂 +5 玛卡巴卡啊哈 2026-03-11 5/250 2026-03-13 21:40 by JourneyLucky
[考研] 工科278分求调剂 +5 周慢热啊 2026-03-12 7/350 2026-03-13 15:49 by JourneyLucky
[考研] 一志愿211化学学硕310分求调剂 +8 努力奋斗112 2026-03-12 9/450 2026-03-13 15:41 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 +3 程雨杭 2026-03-12 3/150 2026-03-13 15:06 by JourneyLucky
[考研] 282分材料专业求调剂院校 +18 枫桥ZL 2026-03-09 25/1250 2026-03-13 10:47 by 白夜悠长
[考研] 290求调剂 +3 ADT 2026-03-13 3/150 2026-03-13 10:19 by peike
[考研] 化工学硕306求调剂 +9 42838695 2026-03-12 9/450 2026-03-13 10:16 by houyaoxu
[考研] 283求调剂，材料、化工皆可 +8 苏打水7777 2026-03-11 10/500 2026-03-13 09:06 by Linda Hu
[考研] 321求调剂（食品/专硕） +3 xc321 2026-03-12 6/300 2026-03-13 08:45 by xc321
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +3 崔wj 2026-03-12 4/200 2026-03-12 19:33 by 求调剂zz
[考研] 纺织、生物、化学、材料相关专业招生了 +4 耶耶业 2026-03-09 7/350 2026-03-12 19:05 by Equinoxhua
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭