| 查看: 1484 | 回复: 6 | ||||
[求助]
关于基因克隆的一些实验技术问题
|
| 小弟基因克隆新手，用的是限制性内切酶和连接，目前遇到两个问题，一个是用内切酶HindIII 和EcoRI 对有目的基因的质粒和PCDNA3.1酶切后，回收胶的回收率特别低，切完后看到的条带还很亮，回收后再电泳就很弱，测浓度发现只有10ng/ul左右，用的是QIAGEN的QIAEX II 试剂盒，小弟自己分析的原因是，50°水浴之后EP管里液体的颜色不够黄，也就是PH太高，没有调PH，还有一个就是在最后加水溶解DNA的时候水的PH偏酸，没有调到8.0。第二个问题是酶切的体系问题，含有目的基因的质粒酶切体系是10ul的Tvector，HindIII 和EcoRI各3ul，buffer4ul,共40ul体系，不知道PCDNA应该用什么样的体系，切多少，好像说连接的时候靶基因对质粒的摩尔数之比要在5-9:1，对这个概念我不是太懂。Tvector浓度是5.6ug/ul，纯化后的PCDNA浓度是0.86ug/ul。 |
回复此楼» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有268人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
关于克隆技术——pcr产物测序问题
已经有16人回复- western blot实验技术
已经有14人回复
- 免疫组化与免疫荧光方法及常见问题分析
已经有325人回复
- 【求助/交流】基因克隆实验为非目的片段？
已经有27人回复
- 【求助/交流】从RNA到cDNA合成再到克隆PCR的实验技巧和操作细节问题若干，寻求解答
已经有12人回复
- 【专题】PCR实验技术指南
已经有535人回复
gyesang
荣誉版主 (著名写手)
-
专家经验: +24 - MolEPI: 31
- 应助: 599 (博士)
- 贵宾: 2.689
- 金币: 24326.9
- 散金: 1088
- 红花: 88
- 沙发: 2
- 帖子: 2327
- 在线: 623.1小时
- 虫号: 849017
- 注册: 2009-09-16
- 性别: GG
- 专业: 细胞信号转导
- 管辖: 分子生物
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sars37: 金币+7, ★★★★★最佳答案 2013-07-13 15:49:40
感谢参与，应助指数 +1
sars37: 金币+7, ★★★★★最佳答案 2013-07-13 15:49:40
|
1. 产物回收后，不用测浓度，到时候连接时，往体系里面多加点片段 2. 你的酶切体系有问题，EcoRI和HindIII酶根本不用这么多 质粒 1ug EcoRI 1ul HindIII 1ul Buffer 2ul ----------------------------- 补齐水到20ul 目的基因的T载体，可以多切些，但1ug也足够了 载体一定要少切，一般400ng足够了，20ul体系，要充分保证载体被酶切开 |
2楼2013-07-13 15:27:08
3楼2013-07-13 15:34:20
gyesang
荣誉版主 (著名写手)
-
专家经验: +24 - MolEPI: 31
- 应助: 599 (博士)
- 贵宾: 2.689
- 金币: 24326.9
- 散金: 1088
- 红花: 88
- 沙发: 2
- 帖子: 2327
- 在线: 623.1小时
- 虫号: 849017
- 注册: 2009-09-16
- 性别: GG
- 专业: 细胞信号转导
- 管辖: 分子生物
4楼2013-07-13 15:35:57
5楼2013-07-13 15:49:21
gyesang
荣誉版主 (著名写手)
-
专家经验: +24 - MolEPI: 31
- 应助: 599 (博士)
- 贵宾: 2.689
- 金币: 24326.9
- 散金: 1088
- 红花: 88
- 沙发: 2
- 帖子: 2327
- 在线: 623.1小时
- 虫号: 849017
- 注册: 2009-09-16
- 性别: GG
- 专业: 细胞信号转导
- 管辖: 分子生物
6楼2013-07-13 15:58:39
7楼2013-07-13 18:24:34