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sars37

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[求助] 关于基因克隆的一些实验技术问题

小弟基因克隆新手，用的是限制性内切酶和连接，目前遇到两个问题，一个是用内切酶HindIII 和EcoRI 对有目的基因的质粒和PCDNA3.1酶切后，回收胶的回收率特别低，切完后看到的条带还很亮，回收后再电泳就很弱，测浓度发现只有10ng/ul左右，用的是QIAGEN的QIAEX II 试剂盒，小弟自己分析的原因是，50°水浴之后EP管里液体的颜色不够黄，也就是PH太高，没有调PH，还有一个就是在最后加水溶解DNA的时候水的PH偏酸，没有调到8.0。第二个问题是酶切的体系问题，含有目的基因的质粒酶切体系是10ul的Tvector，HindIII 和EcoRI各3ul，buffer4ul,共40ul体系，不知道PCDNA应该用什么样的体系，切多少，好像说连接的时候靶基因对质粒的摩尔数之比要在5-9:1，对这个概念我不是太懂。Tvector浓度是5.6ug/ul，纯化后的PCDNA浓度是0.86ug/ul。
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1楼 2013-07-13 15:17:06
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gyesang

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【答案】应助回帖

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sars37: 金币+7, ★★★★★最佳答案 2013-07-13 15:49:40
1. 产物回收后，不用测浓度，到时候连接时，往体系里面多加点片段

2. 你的酶切体系有问题，EcoRI和HindIII酶根本不用这么多
质粒 1ug
EcoRI 1ul
HindIII 1ul
Buffer  2ul
-----------------------------
补齐水到20ul

目的基因的T载体，可以多切些，但1ug也足够了

载体一定要少切，一般400ng足够了，20ul体系，要充分保证载体被酶切开
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2楼2013-07-13 15:27:08
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sars37

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2楼: Originally posted by gyesang at 2013-07-13 15:27:08
1. 产物回收后，不用测浓度，到时候连接时，往体系里面多加点片段

2. 你的酶切体系有问题，EcoRI和HindIII酶根本不用这么多
质粒 1ug
EcoRI 1ul
HindIII 1ul
Buffer  2ul
-----------------------------
补 ...

我的质粒浓度是5.6ug/ul，PCDNA的浓度是0.8ug/ul，也就是说把质粒稀释五倍后吸1ul酶切，PCDNA稀释两倍后吸1ul酶切吗？
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3楼2013-07-13 15:34:20
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gyesang

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3楼: Originally posted by sars37 at 2013-07-13 15:34:20
我的质粒浓度是5.6ug/ul，PCDNA的浓度是0.8ug/ul，也就是说把质粒稀释五倍后吸1ul酶切，PCDNA稀释两倍后吸1ul酶切吗？...

是这样子的，一定要控制好酶切的DNA量
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4楼2013-07-13 15:35:57
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sars37

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4楼: Originally posted by gyesang at 2013-07-13 15:35:57
是这样子的，一定要控制好酶切的DNA量...

好的，谢谢，关于T4连接酶的一些问题可能还要麻烦你。。比如反应体系什么的。。不知道DNA片段和载体DNA的pmol如何换算。
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5楼2013-07-13 15:49:21
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gyesang

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5楼: Originally posted by sars37 at 2013-07-13 15:49:21
好的，谢谢，关于T4连接酶的一些问题可能还要麻烦你。。比如反应体系什么的。。不知道DNA片段和载体DNA的pmol如何换算。...

我一般不考虑片段和载体的mol比等问题，但有一个原则就是尽量多的加你的片段和少加载体，体系一般用小体积连接，比如10ul，我3-15ul的体系都用过，你可以试试10ul体系

片段   若干，多加点
载体   400ng酶切回收20ul洗脱的话，加2ul足够了
10X T4 ligase buffer 1ul
Ligase   1ul
-----------------------------------
补水到10ul
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6楼2013-07-13 15:58:39
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sars37

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6楼: Originally posted by gyesang at 2013-07-13 15:58:39
我一般不考虑片段和载体的mol比等问题，但有一个原则就是尽量多的加你的片段和少加载体，体系一般用小体积连接，比如10ul，我3-15ul的体系都用过，你可以试试10ul体系

片段   若干，多加点
载体   400ng酶切回 ...

那个，我还想再问一下，用QIAEXII这个试剂盒回收胶，做胶的TBE要用1mM EDTA,ph8.0调PH值吗，TBE的PH值要调到多少呢？电泳液也要调吗？
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7楼2013-07-13 18:24:34
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