应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于基因克隆的一些实验技术问题
51/1返回列表
查看: 1644  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

sars37

捐助贵宾 (小有名气)

[求助] 关于基因克隆的一些实验技术问题

小弟基因克隆新手，用的是限制性内切酶和连接，目前遇到两个问题，一个是用内切酶HindIII 和EcoRI 对有目的基因的质粒和PCDNA3.1酶切后，回收胶的回收率特别低，切完后看到的条带还很亮，回收后再电泳就很弱，测浓度发现只有10ng/ul左右，用的是QIAGEN的QIAEX II 试剂盒，小弟自己分析的原因是，50°水浴之后EP管里液体的颜色不够黄，也就是PH太高，没有调PH，还有一个就是在最后加水溶解DNA的时候水的PH偏酸，没有调到8.0。第二个问题是酶切的体系问题，含有目的基因的质粒酶切体系是10ul的Tvector，HindIII 和EcoRI各3ul，buffer4ul,共40ul体系，不知道PCDNA应该用什么样的体系，切多少，好像说连接的时候靶基因对质粒的摩尔数之比要在5-9:1，对这个概念我不是太懂。Tvector浓度是5.6ug/ul，纯化后的PCDNA浓度是0.86ug/ul。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-07-13 15:17:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sars37

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-07-13 15:27:08
1. 产物回收后，不用测浓度，到时候连接时，往体系里面多加点片段

2. 你的酶切体系有问题，EcoRI和HindIII酶根本不用这么多
质粒 1ug
EcoRI 1ul
HindIII 1ul
Buffer  2ul
-----------------------------
补 ...

我的质粒浓度是5.6ug/ul，PCDNA的浓度是0.8ug/ul，也就是说把质粒稀释五倍后吸1ul酶切，PCDNA稀释两倍后吸1ul酶切吗？
赞一下 回复此楼
3楼2013-07-13 15:34:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sars37: 金币+7, ★★★★★最佳答案 2013-07-13 15:49:40
1. 产物回收后，不用测浓度，到时候连接时，往体系里面多加点片段

2. 你的酶切体系有问题，EcoRI和HindIII酶根本不用这么多
质粒 1ug
EcoRI 1ul
HindIII 1ul
Buffer  2ul
-----------------------------
补齐水到20ul

目的基因的T载体，可以多切些，但1ug也足够了

载体一定要少切，一般400ng足够了，20ul体系，要充分保证载体被酶切开
赞一下(1人) 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-07-13 15:27:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
3楼: Originally posted by sars37 at 2013-07-13 15:34:20
我的质粒浓度是5.6ug/ul，PCDNA的浓度是0.8ug/ul，也就是说把质粒稀释五倍后吸1ul酶切，PCDNA稀释两倍后吸1ul酶切吗？...

是这样子的，一定要控制好酶切的DNA量
赞一下(1人) 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-07-13 15:35:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sars37

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2013-07-13 15:35:57
是这样子的，一定要控制好酶切的DNA量...

好的，谢谢，关于T4连接酶的一些问题可能还要麻烦你。。比如反应体系什么的。。不知道DNA片段和载体DNA的pmol如何换算。
赞一下 回复此楼
5楼2013-07-13 15:49:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 7 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料专硕326求调剂 +5 墨煜姒莘 2026-03-15 5/250 2026-03-16 21:30 by 木瓜膏
[考研] 药学383 求调剂 +3 药学chy 2026-03-15 4/200 2026-03-16 20:51 by 元子^0^
[考研] 机械专硕325，寻找调剂院校 +3 y9999 2026-03-15 5/250 2026-03-16 19:58 by y9999
[考研] 一志愿985，本科211，0817化学工程与技术319求调剂 +5 Liwangman 2026-03-15 5/250 2026-03-16 17:10 by 我的船我的海
[考研] 材料与化工求调剂 +3 为学666 2026-03-16 3/150 2026-03-16 15:09 by 加号+
[考研] 294求调剂 +3 Zys010410@ 2026-03-13 4/200 2026-03-15 10:59 by zhq0425
[考研] 材料与化工 323 英一+数二+物化，一志愿：哈工大 本人本科双一流 +4 自由的_飞翔 2026-03-13 5/250 2026-03-14 19:39 by hmn_wj
[考研] 308 085701 四六级已过求调剂 +7 温乔乔乔乔 2026-03-12 14/700 2026-03-14 10:49 by JourneyLucky
[考研] 307求调剂 +7 超级伊昂大王 2026-03-10 7/350 2026-03-14 00:49 by JourneyLucky
[考研] 311求调剂 +8 zchqwer 2026-03-10 8/400 2026-03-14 00:01 by JourneyLucky
[考研] 279求调剂 +3 抓着星星的女孩 2026-03-10 3/150 2026-03-13 23:47 by userper
[考研] 0805，333求调剂 +3 112253525 2026-03-10 3/150 2026-03-13 23:42 by JourneyLucky
[考研] 285 求调剂 资源与环境 一志愿北京化工大学 +3 未名考生 2026-03-10 3/150 2026-03-13 23:04 by JourneyLucky
[考研] 293求调剂 +3 世界首富 2026-03-11 3/150 2026-03-13 16:27 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 +3 程雨杭 2026-03-12 3/150 2026-03-13 15:06 by JourneyLucky
[考研] 材料专硕274一志愿陕西师范大学求调剂 +4 薛云鹏 2026-03-13 4/200 2026-03-13 10:40 by 学员8dgXkO
[考博] 福州大学杨黄浩课题组招收2026年专业学位博士研究生，2026.03.20截止 +3 Xiangyu_ou 2026-03-12 3/150 2026-03-13 09:36 by duanwu655
[考研] 大连大学化学专业研究生调剂 +3 琪久. 2026-03-10 8/400 2026-03-11 10:02 by 琪久.
[基金申请] 提交后的基金本子，已让学校撤回了，可否换口子提交 +3 dut_pfx 2026-03-10 3/150 2026-03-11 08:38 by kudofaye
[考研] 化工0817调剂 +8 灿若星晨 2026-03-10 8/400 2026-03-10 22:44 by 星空星月
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭