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关于基因克隆的一些实验技术问题
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| 小弟基因克隆新手，用的是限制性内切酶和连接，目前遇到两个问题，一个是用内切酶HindIII 和EcoRI 对有目的基因的质粒和PCDNA3.1酶切后，回收胶的回收率特别低，切完后看到的条带还很亮，回收后再电泳就很弱，测浓度发现只有10ng/ul左右，用的是QIAGEN的QIAEX II 试剂盒，小弟自己分析的原因是，50°水浴之后EP管里液体的颜色不够黄，也就是PH太高，没有调PH，还有一个就是在最后加水溶解DNA的时候水的PH偏酸，没有调到8.0。第二个问题是酶切的体系问题，含有目的基因的质粒酶切体系是10ul的Tvector，HindIII 和EcoRI各3ul，buffer4ul,共40ul体系，不知道PCDNA应该用什么样的体系，切多少，好像说连接的时候靶基因对质粒的摩尔数之比要在5-9:1，对这个概念我不是太懂。Tvector浓度是5.6ug/ul，纯化后的PCDNA浓度是0.86ug/ul。 |
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3楼2013-07-13 15:34:20
gyesang
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1. 产物回收后，不用测浓度，到时候连接时，往体系里面多加点片段 2. 你的酶切体系有问题，EcoRI和HindIII酶根本不用这么多 质粒 1ug EcoRI 1ul HindIII 1ul Buffer 2ul ----------------------------- 补齐水到20ul 目的基因的T载体，可以多切些，但1ug也足够了 载体一定要少切，一般400ng足够了，20ul体系，要充分保证载体被酶切开 |
2楼2013-07-13 15:27:08
gyesang
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4楼2013-07-13 15:35:57
5楼2013-07-13 15:49:21
