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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求关于Overlap PCR(重叠延伸PCR)的具体实验过程及原理
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我是传奇456

金虫 (正式写手)

[求助] 求关于Overlap PCR(重叠延伸PCR)的具体实验过程及原理

求关于Overlap PCR(重叠延伸PCR)的具体实验过程及原理，最好是文献或者书籍章节，中英文都可以~

[ 来自科研家族 外貌协会 ]
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1楼 2012-12-03 15:25:38
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回帖置顶 ( 共有1个 )

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+5, MolEPI+1, very good 2012-12-03 16:55:36
我是传奇456: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 很好，很详细。 2012-12-03 20:33:29
重叠延伸PCR，我觉得可以分两种：

第一种：用重叠延伸PCR做定点突变，采用重叠引物延伸PCR介导做定点突变实际上是一种快速高效的在基因中特定位点引入特定突变的有效技术。其基本原理就是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了一小段的重叠链, 然后在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。
该技术主要包括以下几步：
(1) 设计引物，PCR扩增基因两端
(2) 回收两端片段
(3) 两端片段退火延伸，扩增全长基因

1. 引物设计
重叠延伸PCR做定点突变引物的设计，如下图所示。
引物F及R为基因两端特异引物，其中Fm及Rm为中间引物。其中引物Fm及Rm中间共享一段序列（至少10bp完全匹配），*为突变点，突变点最好是位于引物的5’端，尽量避免出现在3’端。然后分别用引物F和Rm及Fm和R进行配对进行PCR。该步一定要用pfu酶，不能用Taq酶，因为Taq酶容易在PCR产物末端加A，会造成产物移码突变。
2. 分别回收第1步所得两条PCR产物
3. 将第2步所得两份PCR产物进行混合使其互为模板及引物，加入dNTP及Pfu或Taq酶及引物F和R进行PCR扩增出具有突变的全基因。



第二种：用重叠延伸PCR做序列缺失突变，即重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)
以下是重叠延伸PCR的原理及两基因的引物设计：
（1）引物设计：引物a和d是常规引物；b的左半段为常规引物，右半段为基因Ⅱ的引物序列；c同理；则b和c的部分碱基可互补配对。
（2）基因I、Ⅱ分别扩增，产物相应为片段ab和cd。
（3）两种产物混合，经变性及退火处理，a链和d链部分碱基互补配对，成杂交链。在DNA polymerase作用下，a和d链互为引物和模板，合成出长'链，即为基因I和基因Ⅱ的接接产物。



2012-12-03_160715.jpg
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2012-12-03 16:45:55
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普通回帖

diandong

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
3楼2012-12-03 19:36:36
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Yummyoo

金虫 (小有名气)
学习了，谢谢
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4楼2013-03-17 20:22:35
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xcchh

银虫 (小有名气)
mark
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5楼2013-04-22 17:02:14
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海妖贝壳

木虫 (正式写手)
nice
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幸福是美丽的
6楼2013-05-14 16:22:43
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xmckyltwx

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2012-12-03 16:45:55
重叠延伸PCR，我觉得可以分两种：

第一种：用重叠延伸PCR做定点突变，采用重叠引物延伸PCR介导做定点突变实际上是一种快速高效的在基因中特定位点引入特定突变的有效技术。其基本原理就是采用具有互补末端的引物 ...

想请教一下如果想做一个片段的基因敲除该怎么办，就是将一个基因的上游和下游各500bp和一个抗性基因连起来 这样可以么，我是新手，肯请指教~~
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成功的起点是坚信，成功的终点是坚持~~
7楼2013-06-14 15:55:08
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lovelytt

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2012-12-03 16:45:55
重叠延伸PCR，我觉得可以分两种：

第一种：用重叠延伸PCR做定点突变，采用重叠引物延伸PCR介导做定点突变实际上是一种快速高效的在基因中特定位点引入特定突变的有效技术。其基本原理就是采用具有互补末端的引物 ...

变性及退火处理是指不延伸么 要几个循环呀 温度怎么设置好 求指教
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8楼2013-06-16 10:41:51
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猫咪安妮

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lovelytt at 2013-06-16 10:41:51
变性及退火处理是指不延伸么 要几个循环呀 温度怎么设置好 求指教...

hi
请问你的问题解决了么？
我最近准备做Overlap PCR，遇到了相同的问题。我从论坛上了解到，形成杂交链那步需要5~10个cycles就可以了。但我不了解的是，这个过程中延伸是否需要，退火温度如何设置？
求指导，谢谢！
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9楼2013-11-20 17:58:45
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董晶dj

铜虫 (小有名气)
很有用，谢谢了
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10楼2013-12-18 11:46:35
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