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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+5, MolEPI+1, very good 2012-12-03 16:55:36
我是传奇456: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 很好，很详细。 2012-12-03 20:33:29

重叠延伸PCR，我觉得可以分两种：

第一种：用重叠延伸PCR做定点突变，采用重叠引物延伸PCR介导做定点突变实际上是一种快速高效的在基因中特定位点引入特定突变的有效技术。其基本原理就是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了一小段的重叠链, 然后在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。
该技术主要包括以下几步：
(1) 设计引物，PCR扩增基因两端
(2) 回收两端片段
(3) 两端片段退火延伸，扩增全长基因

1. 引物设计
重叠延伸PCR做定点突变引物的设计，如下图所示。
引物F及R为基因两端特异引物，其中Fm及Rm为中间引物。其中引物Fm及Rm中间共享一段序列（至少10bp完全匹配），*为突变点，突变点最好是位于引物的5’端，尽量避免出现在3’端。然后分别用引物F和Rm及Fm和R进行配对进行PCR。该步一定要用pfu酶，不能用Taq酶，因为Taq酶容易在PCR产物末端加A，会造成产物移码突变。
2. 分别回收第1步所得两条PCR产物
3. 将第2步所得两份PCR产物进行混合使其互为模板及引物，加入dNTP及Pfu或Taq酶及引物F和R进行PCR扩增出具有突变的全基因。

第二种：用重叠延伸PCR做序列缺失突变，即重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)
以下是重叠延伸PCR的原理及两基因的引物设计：
（1）引物设计：引物a和d是常规引物；b的左半段为常规引物，右半段为基因Ⅱ的引物序列；c同理；则b和c的部分碱基可互补配对。
（2）基因I、Ⅱ分别扩增，产物相应为片段ab和cd。
（3）两种产物混合，经变性及退火处理，a链和d链部分碱基互补配对，成杂交链。在DNA polymerase作用下，a和d链互为引物和模板，合成出长'链，即为基因I和基因Ⅱ的接接产物。

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