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PCR 克隆 问题，小弟新手，求帮助。已有3人参与
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最近很不顺利，不知到底是哪儿出现了问题。 目的片段，1800-—2500bp 中间含有太多重复序列。 载体：PMD19-T 第一点、PCR扩增 ， 电泳回收 (试剂盒回收并电泳检测） 连接：DNA:7.7 BUFFER:1 T4酶：1 pmd19-T：0.3 过夜16H左右。 转化：感受态是自己做的，涂板过夜培养一般长的很好，不知道是否代表感受态没有问题？ PCR阳性鉴定：r-taq酶，最近一直没有结果。 第二点、将PCR鉴定有阳性的用来提取质粒，做亚克隆，因为重复序列多，2000bp+的一般不容易测通。 双酶切之后电泳回收，条带明显存在梯度，是否代表这一步成功了。 然后，再一次连接 DNA:8 T4酶：1 BUFFER:1 过夜16度 16H 转化也能长得很好，感受态还是用自己做的，但是阳性仍然没有。 途中曾经将未检测到阳性的 送到公司测序，显示空载。 所以我想是不是连接没有连接上？还是感受态问题？还是实验室药品有问题（大家阳性检测也很少很少，但我没有）？还是我以上步骤存在问题？特别是第二点亚克隆是否存在问题？ |
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