应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR 克隆 问题，小弟新手，求帮助。
51/1返回列表
查看: 1367  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

zlimba

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR 克隆 问题，小弟新手，求帮助。 已有3人参与

最近很不顺利，不知到底是哪儿出现了问题。

目的片段，1800-—2500bp     中间含有太多重复序列。

载体：PMD19-T

第一点、PCR扩增 ，  电泳回收 (试剂盒回收并电泳检测）
连接：DNA:7.7
          BUFFER:1
          T4酶：1
          pmd19-T：0.3             过夜16H左右。
转化：感受态是自己做的，涂板过夜培养一般长的很好，不知道是否代表感受态没有问题？
PCR阳性鉴定：r-taq酶，最近一直没有结果。
第二点、将PCR鉴定有阳性的用来提取质粒，做亚克隆，因为重复序列多，2000bp+的一般不容易测通。
双酶切之后电泳回收，条带明显存在梯度，是否代表这一步成功了。
然后，再一次连接
     DNA:8
     T4酶：1
     BUFFER:1
过夜16度  16H
转化也能长得很好，感受态还是用自己做的，但是阳性仍然没有。


途中曾经将未检测到阳性的 送到公司测序，显示空载。

所以我想是不是连接没有连接上？还是感受态问题？还是实验室药品有问题（大家阳性检测也很少很少，但我没有）？还是我以上步骤存在问题？特别是第二点亚克隆是否存在问题？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-04-22 14:48:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dizang2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-26 09:34:54
这个就太扯了，pmd19t做ta的话，a尾没加，然后链接体系不对：buffer看看是不是浓度正确的，takara的应该是2x的，还有takara的buffer里有链接酶的，不需要再加
赞一下 回复此楼
8楼2014-05-26 09:12:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答

猪尾巴草

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-04-22 23:15:03
1、我问一下，你第一步PCR出目的基因连接了，为何还要再酶切连接？
2、如果你想知道是不是感受态的问题，你可以导个空载体到感受态里和不导载体涂板看看
赞一下 回复此楼
2楼2014-04-22 19:49:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xygcdmr

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zlimba(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-04-23 12:06:15
电泳回收后要再跑个电泳看下条带亮度，确定回收成功，可以的话还可以测浓度，如果很亮，或者浓度高，连接的时候DNA就没必要加太多，可能2-3就可以，载体0.3有点少，10的体系，应该加1。
PCR阳性检测时，假阳性太高，退火温度要很高来减少假阳性才行，可以只比引物TM值低1-2度，提完质粒做酶切鉴定更可靠。送测序就OK了，一次成功，不用二次连接的。
赞一下 回复此楼
3楼2014-04-23 01:08:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xygcdmr

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-05-26 09:34:45
确定加对了抗生素，涂板长得很好，就不是感受态的问题，可以转一个对照质粒试试。一般质粒会长得密密麻麻。
赞一下 回复此楼
4楼2014-04-23 01:10:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿华东理工大学081700，初试分数271 +4 kotoko_ik 2026-03-23 5/250 2026-03-23 23:23 by 呆呆师姐
[考研] 一志愿211 初试270分 求调剂 +4 谷雨上岸 2026-03-23 5/250 2026-03-23 21:18 by 不惑可乐
[考研] 一志愿上海交大生物与医药专硕324分，求调剂 +5 jiajunX 2026-03-22 5/250 2026-03-23 18:07 by YMU施老师
[考研] 276求调剂。有半年电池和半年高分子实习经历 +8 材料学257求调剂 2026-03-23 9/450 2026-03-23 13:01 by ztnimte
[考研] 333求调剂 +6 87639 2026-03-21 10/500 2026-03-23 10:41 by Iveryant
[考研] 276求调剂 +3 YNRYG 2026-03-21 4/200 2026-03-23 08:31 by 醉在风里
[考研] 352求调剂 +3 大米饭！ 2026-03-22 3/150 2026-03-22 23:28 by king123！
[考研] 293求调剂 +3 涛涛Wjt 2026-03-22 5/250 2026-03-22 22:21 by jiangpengfei
[考研] 311求调剂 +6 冬十三 2026-03-18 6/300 2026-03-22 20:18 by edmund7
[考研] 285求调剂 +6 ytter 2026-03-22 6/300 2026-03-22 12:09 by 星空星月
[考研] 材料学硕301分求调剂 +7 Liyouyumairs 2026-03-21 7/350 2026-03-21 22:31 by peike
[考研] 材料与化工（0856）304求B区调剂 +3 邱gl 2026-03-20 7/350 2026-03-21 19:05 by 15709483992
[考研] 求调剂 +3 .m.. 2026-03-21 4/200 2026-03-21 16:25 by barlinike
[考研] 考研调剂求学校推荐 +3 伯乐29 2026-03-18 5/250 2026-03-20 22:59 by JourneyLucky
[考研] 材料与化工 322求调剂 +4 然11 2026-03-19 4/200 2026-03-20 22:12 by luoyongfeng
[考研] 材料学求调剂 +4 Stella_Yao 2026-03-20 4/200 2026-03-20 20:28 by ms629
[考研] 261求B区调剂，科研经历丰富 +3 牛奶很忙 2026-03-20 4/200 2026-03-20 19:34 by JourneyLucky
[考研] 收复试调剂生 +4 雨后秋荷 2026-03-18 4/200 2026-03-18 14:16 by elevennnne
[考研] 0703化学调剂 +3 妮妮ninicgb 2026-03-17 3/150 2026-03-18 10:29 by macy2011
[考研] 考研求调剂 +3 橘颂. 2026-03-17 4/200 2026-03-17 21:43 by 有只狸奴
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭