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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体去磷酸化后的回收问题
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杨玉焕123

木虫 (小有名气)

阳光

[求助] 载体去磷酸化后的回收问题 已有5人参与

本人用的是单酶切，自连现象很严重，需要去磷酸化，选用的是CIAP，按照说明50度反应30分钟后采用以下2种方法：
  1、PCR产物纯化试剂盒回收
  2、65度反应30分钟使酶失活，然后用等体积的酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇抽提一次，之后加入1/20倍体积5M的氯化钠和2倍体积的无水乙醇（加乙醇的时候明显能看到絮状产生），-20℃沉淀1h，13000rpm离心2min后弃上清，然后用70%的乙醇洗涤一遍，吹干后加10微升无菌去离子水溶解
各 取2微升1、2所得溶液进行电泳检测，1能看到DNA条带，2没有，对二者分别进行载体的连接反应（实验组：载体、片段、T4连接酶、T4buffer，对照组：载体、T4连接酶、T4buffer）、转化实验，结果为方法1的实验组和对照组上克隆子数目都很多，挑取实验组进行质粒快抽发现都是载体自连产生的克隆。。。。方法2的实验组和对照组均没有克隆子生长。。。
  后来又做过几次方法2 ，发现方法2的去磷酸化效果挺好的，对照有10个左右克隆子，实验组片段与载体也连上了，但是由于每次去磷酸化之后载体回收后电泳都检测不到，浓度相当的低。。。，没法获得足够多的克隆子（我需要的是建立基因组文库，克隆子数目很大）。目前，正在尝试延长磷酸化反应时间，再用PCR产物纯化试剂盒回收，请问各位大侠对于方法2的DNA回收有没什么好的建议？我看到有的文献是加入1/10体积的3M醋酸钠，pH为5.2，这又是为什么呢？加盐的目的不就是为了中和电荷使DNA更容易沉淀么？跟所加盐溶液的pH没有太大的关系吧？？求指教
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1楼 2014-01-16 15:28:11
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回帖置顶 ( 共有2个 )

2014神虫浮云

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-19 20:07:59
gyesang: 回帖置顶 2014-02-19 20:08:09
1/10体积的3M醋酸钠，pH为5.2,这样才能沉淀出DNA，而且可以在冰箱-20度沉淀半个小时，离心后去上清，再用70%乙醇洗一次，再风干重融。效果会更好。试试吧，效果好的话可要多给金币吆。
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ffgtfvtyju7hjhv
7楼2014-02-19 19:54:39
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
★ ★
杨玉焕123: 回帖置顶 2014-02-25 11:52:33
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-25 13:01:59
引用回帖:
13楼: Originally posted by 杨玉焕123 at 2014-02-24 21:22:26
呵呵，能说一下你是怎么洗和晾干么？我现在离心之后都不吸干净，然后用吹风机吹干再加水溶解...

会不会是试剂不纯？或者污染了DNA酶什么的？我的操作和你的差不多，把完整步骤写出来吧：
1、加入1/20倍体积5M的氯化钠，加入1/10电泳buffer（主要为了带蓝色好看清分层）。
2、加入等体积氯仿充分混匀，12000rpm 3min，保留上清。
3、加入2倍体积乙醇，充分混匀，12000rpm 10min，小心吸走上清。
4、加入适量75%乙醇，12000rpm 2min，小心吸走上清，用10uL枪头在不碰到沉淀的前提下尽量吸走乙醇。
5、室温晾干，或者放37度培养箱中晾干，或者放真空泵中抽干。
6、加双蒸水溶解。
和回收率相关的关键步骤是第2步上清的保留量和第3步离心时间。然后就是注意小心不要搞丢了DNA沉淀了.
要找原因的话，建议各个步骤都取一点液体出来跑胶看看DNA的量。
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杨玉焕123
14楼2014-02-24 22:21:54
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
杨玉焕123: 金币+16, ★有帮助 2014-03-04 10:36:24
引用回帖:
20楼: Originally posted by 杨玉焕123 at 2014-03-04 09:42:00
不好意思，再打扰一下，你写的第二步中用的是氯仿？不是酚仿？还有用75%乙醇洗涤时，体积大概是多少呢？谢谢哈...

哦，写错了，是氯仿异戊醇。没用过酚。
我在200 uL PCR管里操作，加几十到100 uL乙醇吧。PCR管套到0.5 mL离心管再套到1.5 mL离心管里再去离心。

你这是要做载体单酶切去磷酸化吗？有些限制酶的buffer和CIP是兼容的，譬如Thermo的fast digest。我是用Thermo的快酶，20uL 体系37度酶切反应半小时后，直接加Takara的cip 0.5～1 uL，继续37度反应1小时，高温失活，跑胶回收。这样就省下一个回收步骤了。
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21楼2014-03-04 10:22:52
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普通回帖

DAX1

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
杨玉焕123(kx444555代发): 金币+5, 鼓励交流 2014-01-17 12:47:09
杨玉焕123: 金币+10, ★有帮助 2014-01-17 14:47:14
一般乙醇沉淀的效率会非常高的，基本都在90%以上啊。和你们的区别就是我们用的是5.2的醋酸钠，然后我们离心是10分钟。要不你延长离心时间，都能看见絮状沉淀了。
你要是实在不行就换胶回收试剂盒啊。国产天跟阿之类的都特别好用。
ps你们用的啥ciap，竟然反应温度为50度啊
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2楼2014-01-17 00:32:20
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杨玉焕123

木虫 (小有名气)

阳光
引用回帖:
2楼: Originally posted by DAX1 at 2014-01-16 04:32:20
一般乙醇沉淀的效率会非常高的，基本都在90%以上啊。和你们的区别就是我们用的是5.2的醋酸钠，然后我们离心是10分钟。要不你延长离心时间，都能看见絮状沉淀了。
你要是实在不行就换胶回收试剂盒啊。国产天跟阿之类 ...

现在新买的是Takara的，说明书上写的是37或者50℃，应该没问题啊，试剂盒也试过，因为载体含量就不高，而且为了保证克隆效率，不能紫外照射，电泳后还得先切出一半看载体DNA的位置，所以损失也很大，我先都试试吧，谢谢哈
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3楼2014-01-17 10:54:17
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银杏酸酸

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-01-17 12:47:13
杨玉焕123: 金币+5, ★有帮助 2014-01-17 14:46:52
你醇沉时间太短了，我之前也有做过，醇沉离心后在管壁上应该能看到很小很小的沉淀，然后用水溶它，跑出来的胶条带特别亮。
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4楼2014-01-17 11:08:22
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杨玉焕123

木虫 (小有名气)

阳光
引用回帖:
4楼: Originally posted by 银杏酸酸 at 2014-01-16 15:08:22
你醇沉时间太短了，我之前也有做过，醇沉离心后在管壁上应该能看到很小很小的沉淀，然后用水溶它，跑出来的胶条带特别亮。

好的，谢谢，我明天看看方法一的结果，不行再试方法二
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5楼2014-01-17 14:46:55
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qiaozheng1

木虫 (正式写手)
学习了
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6楼2014-01-17 21:14:09
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-02-20 08:26:55
方法2你都看到絮状 沉淀了，居然跑胶没东西？不会是被吹跑了吧....洗和晾干都要十分小心啊。
-20℃沉淀1h完全可以省略，除了增加杂质以外没有其它效果。不过离心时间增加到5 min以上可能比较好。
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8楼2014-02-19 20:22:37
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forrestgump

新虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
杨玉焕123(kx444555代发): 金币+4, 鼓励交流 2014-02-20 08:27:00
杨玉焕123: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-02-24 21:15:44
对于2我想说几点，毕竟我回收小RNA都成功了，还是PAGE回收，所以我有发言权，金币多多的给。
（1）我没有见过加Nacl进行促沉的，这种盐离子也很难去除，但是加醋酸钠时可以的，毕竟这个是弱酸强碱盐类，具有一定的缓冲性能。（2）-20度促沉也是对的，但是你的离心时间是否非常短，我做一般的都10min，做小RNA得高速离心半小时，你才2分钟。（3）利用酚仿抽提也会损失20-40%。（4）最后你又洗了一遍也会损失一点。所以综合因素2不见产物不足为怪。
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9楼2014-02-19 22:43:04
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许琼琼

新虫 (初入文坛)
我想请问一下，你单酶切处理以后不进行纯化处理吗？
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10楼2014-02-24 10:38:54
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