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杨玉焕123木虫 (小有名气)
阳光
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载体去磷酸化后的回收问题 已有5人参与
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本人用的是单酶切，自连现象很严重，需要去磷酸化，选用的是CIAP，按照说明50度反应30分钟后采用以下2种方法： 1、PCR产物纯化试剂盒回收 2、65度反应30分钟使酶失活，然后用等体积的酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇抽提一次，之后加入1/20倍体积5M的氯化钠和2倍体积的无水乙醇（加乙醇的时候明显能看到絮状产生），-20℃沉淀1h，13000rpm离心2min后弃上清，然后用70%的乙醇洗涤一遍，吹干后加10微升无菌去离子水溶解 各 取2微升1、2所得溶液进行电泳检测，1能看到DNA条带，2没有，对二者分别进行载体的连接反应（实验组：载体、片段、T4连接酶、T4buffer，对照组：载体、T4连接酶、T4buffer）、转化实验，结果为方法1的实验组和对照组上克隆子数目都很多，挑取实验组进行质粒快抽发现都是载体自连产生的克隆。。。。方法2的实验组和对照组均没有克隆子生长。。。 后来又做过几次方法2 ，发现方法2的去磷酸化效果挺好的，对照有10个左右克隆子，实验组片段与载体也连上了，但是由于每次去磷酸化之后载体回收后电泳都检测不到，浓度相当的低。。。，没法获得足够多的克隆子（我需要的是建立基因组文库，克隆子数目很大）。目前，正在尝试延长磷酸化反应时间，再用PCR产物纯化试剂盒回收，请问各位大侠对于方法2的DNA回收有没什么好的建议？我看到有的文献是加入1/10体积的3M醋酸钠，pH为5.2，这又是为什么呢？加盐的目的不就是为了中和电荷使DNA更容易沉淀么？跟所加盐溶液的pH没有太大的关系吧？？求指教 |
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7楼2014-02-19 19:54:39
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杨玉焕123: 回帖置顶 2014-02-25 11:52:33
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-25 13:01:59
杨玉焕123: 回帖置顶 2014-02-25 11:52:33
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会不会是试剂不纯？或者污染了DNA酶什么的？我的操作和你的差不多，把完整步骤写出来吧： 1、加入1/20倍体积5M的氯化钠，加入1/10电泳buffer（主要为了带蓝色好看清分层）。 2、加入等体积氯仿充分混匀，12000rpm 3min，保留上清。 3、加入2倍体积乙醇，充分混匀，12000rpm 10min，小心吸走上清。 4、加入适量75%乙醇，12000rpm 2min，小心吸走上清，用10uL枪头在不碰到沉淀的前提下尽量吸走乙醇。 5、室温晾干，或者放37度培养箱中晾干，或者放真空泵中抽干。 6、加双蒸水溶解。 和回收率相关的关键步骤是第2步上清的保留量和第3步离心时间。然后就是注意小心不要搞丢了DNA沉淀了. 要找原因的话，建议各个步骤都取一点液体出来跑胶看看DNA的量。 |
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杨玉焕12314楼2014-02-24 22:21:54
【答案】应助回帖
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杨玉焕123: 金币+16, ★有帮助 2014-03-04 10:36:24
杨玉焕123: 金币+16, ★有帮助 2014-03-04 10:36:24
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哦，写错了，是氯仿异戊醇。没用过酚。 我在200 uL PCR管里操作，加几十到100 uL乙醇吧。PCR管套到0.5 mL离心管再套到1.5 mL离心管里再去离心。 你这是要做载体单酶切去磷酸化吗？有些限制酶的buffer和CIP是兼容的，譬如Thermo的fast digest。我是用Thermo的快酶，20uL 体系37度酶切反应半小时后，直接加Takara的cip 0.5～1 uL，继续37度反应1小时，高温失活，跑胶回收。这样就省下一个回收步骤了。 |
21楼2014-03-04 10:22:52
2楼2014-01-17 00:32:20
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【答案】应助回帖
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杨玉焕123(kx444555代发): 金币+4, 鼓励交流 2014-02-20 08:27:00
杨玉焕123: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-02-24 21:15:44
杨玉焕123(kx444555代发): 金币+4, 鼓励交流 2014-02-20 08:27:00
杨玉焕123: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-02-24 21:15:44
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对于2我想说几点，毕竟我回收小RNA都成功了，还是PAGE回收，所以我有发言权，金币多多的给。 （1）我没有见过加Nacl进行促沉的，这种盐离子也很难去除，但是加醋酸钠时可以的，毕竟这个是弱酸强碱盐类，具有一定的缓冲性能。（2）-20度促沉也是对的，但是你的离心时间是否非常短，我做一般的都10min，做小RNA得高速离心半小时，你才2分钟。（3）利用酚仿抽提也会损失20-40%。（4）最后你又洗了一遍也会损失一点。所以综合因素2不见产物不足为怪。 |
9楼2014-02-19 22:43:04
10楼2014-02-24 10:38:54
