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杨玉焕123木虫 (小有名气)
阳光
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[求助]
载体去磷酸化后的回收问题 已有5人参与
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本人用的是单酶切，自连现象很严重，需要去磷酸化，选用的是CIAP，按照说明50度反应30分钟后采用以下2种方法： 1、PCR产物纯化试剂盒回收 2、65度反应30分钟使酶失活，然后用等体积的酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇抽提一次，之后加入1/20倍体积5M的氯化钠和2倍体积的无水乙醇（加乙醇的时候明显能看到絮状产生），-20℃沉淀1h，13000rpm离心2min后弃上清，然后用70%的乙醇洗涤一遍，吹干后加10微升无菌去离子水溶解 各 取2微升1、2所得溶液进行电泳检测，1能看到DNA条带，2没有，对二者分别进行载体的连接反应（实验组：载体、片段、T4连接酶、T4buffer，对照组：载体、T4连接酶、T4buffer）、转化实验，结果为方法1的实验组和对照组上克隆子数目都很多，挑取实验组进行质粒快抽发现都是载体自连产生的克隆。。。。方法2的实验组和对照组均没有克隆子生长。。。 后来又做过几次方法2 ，发现方法2的去磷酸化效果挺好的，对照有10个左右克隆子，实验组片段与载体也连上了，但是由于每次去磷酸化之后载体回收后电泳都检测不到，浓度相当的低。。。，没法获得足够多的克隆子（我需要的是建立基因组文库，克隆子数目很大）。目前，正在尝试延长磷酸化反应时间，再用PCR产物纯化试剂盒回收，请问各位大侠对于方法2的DNA回收有没什么好的建议？我看到有的文献是加入1/10体积的3M醋酸钠，pH为5.2，这又是为什么呢？加盐的目的不就是为了中和电荷使DNA更容易沉淀么？跟所加盐溶液的pH没有太大的关系吧？？求指教 |
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杨玉焕123: 回帖置顶 2014-02-25 11:52:33
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-25 13:01:59
杨玉焕123: 回帖置顶 2014-02-25 11:52:33
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-25 13:01:59
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会不会是试剂不纯？或者污染了DNA酶什么的？我的操作和你的差不多，把完整步骤写出来吧： 1、加入1/20倍体积5M的氯化钠，加入1/10电泳buffer（主要为了带蓝色好看清分层）。 2、加入等体积氯仿充分混匀，12000rpm 3min，保留上清。 3、加入2倍体积乙醇，充分混匀，12000rpm 10min，小心吸走上清。 4、加入适量75%乙醇，12000rpm 2min，小心吸走上清，用10uL枪头在不碰到沉淀的前提下尽量吸走乙醇。 5、室温晾干，或者放37度培养箱中晾干，或者放真空泵中抽干。 6、加双蒸水溶解。 和回收率相关的关键步骤是第2步上清的保留量和第3步离心时间。然后就是注意小心不要搞丢了DNA沉淀了. 要找原因的话，建议各个步骤都取一点液体出来跑胶看看DNA的量。 |
杨玉焕12314楼2014-02-24 22:21:54
2楼2014-01-17 00:32:20
杨玉焕123
木虫 (小有名气)
阳光
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- 注册: 2012-10-19
- 性别: MM
- 专业: 生物化工与食品化工
3楼2014-01-17 10:54:17
4楼2014-01-17 11:08:22