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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体去磷酸化后的回收问题
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杨玉焕123

木虫 (小有名气)

阳光

[求助] 载体去磷酸化后的回收问题 已有5人参与

本人用的是单酶切，自连现象很严重，需要去磷酸化，选用的是CIAP，按照说明50度反应30分钟后采用以下2种方法：
  1、PCR产物纯化试剂盒回收
  2、65度反应30分钟使酶失活，然后用等体积的酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇抽提一次，之后加入1/20倍体积5M的氯化钠和2倍体积的无水乙醇（加乙醇的时候明显能看到絮状产生），-20℃沉淀1h，13000rpm离心2min后弃上清，然后用70%的乙醇洗涤一遍，吹干后加10微升无菌去离子水溶解
各 取2微升1、2所得溶液进行电泳检测，1能看到DNA条带，2没有，对二者分别进行载体的连接反应（实验组：载体、片段、T4连接酶、T4buffer，对照组：载体、T4连接酶、T4buffer）、转化实验，结果为方法1的实验组和对照组上克隆子数目都很多，挑取实验组进行质粒快抽发现都是载体自连产生的克隆。。。。方法2的实验组和对照组均没有克隆子生长。。。
  后来又做过几次方法2 ，发现方法2的去磷酸化效果挺好的，对照有10个左右克隆子，实验组片段与载体也连上了，但是由于每次去磷酸化之后载体回收后电泳都检测不到，浓度相当的低。。。，没法获得足够多的克隆子（我需要的是建立基因组文库，克隆子数目很大）。目前，正在尝试延长磷酸化反应时间，再用PCR产物纯化试剂盒回收，请问各位大侠对于方法2的DNA回收有没什么好的建议？我看到有的文献是加入1/10体积的3M醋酸钠，pH为5.2，这又是为什么呢？加盐的目的不就是为了中和电荷使DNA更容易沉淀么？跟所加盐溶液的pH没有太大的关系吧？？求指教
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1楼 2014-01-16 15:28:11
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杨玉焕123

木虫 (小有名气)

阳光
引用回帖:
2楼: Originally posted by DAX1 at 2014-01-16 04:32:20
一般乙醇沉淀的效率会非常高的，基本都在90%以上啊。和你们的区别就是我们用的是5.2的醋酸钠，然后我们离心是10分钟。要不你延长离心时间，都能看见絮状沉淀了。
你要是实在不行就换胶回收试剂盒啊。国产天跟阿之类 ...

现在新买的是Takara的，说明书上写的是37或者50℃，应该没问题啊，试剂盒也试过，因为载体含量就不高，而且为了保证克隆效率，不能紫外照射，电泳后还得先切出一半看载体DNA的位置，所以损失也很大，我先都试试吧，谢谢哈
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3楼2014-01-17 10:54:17
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DAX1

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
杨玉焕123(kx444555代发): 金币+5, 鼓励交流 2014-01-17 12:47:09
杨玉焕123: 金币+10, ★有帮助 2014-01-17 14:47:14
一般乙醇沉淀的效率会非常高的，基本都在90%以上啊。和你们的区别就是我们用的是5.2的醋酸钠，然后我们离心是10分钟。要不你延长离心时间，都能看见絮状沉淀了。
你要是实在不行就换胶回收试剂盒啊。国产天跟阿之类的都特别好用。
ps你们用的啥ciap，竟然反应温度为50度啊
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2楼2014-01-17 00:32:20
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银杏酸酸

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-01-17 12:47:13
杨玉焕123: 金币+5, ★有帮助 2014-01-17 14:46:52
你醇沉时间太短了，我之前也有做过，醇沉离心后在管壁上应该能看到很小很小的沉淀，然后用水溶它，跑出来的胶条带特别亮。
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4楼2014-01-17 11:08:22
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杨玉焕123

木虫 (小有名气)

阳光
引用回帖:
4楼: Originally posted by 银杏酸酸 at 2014-01-16 15:08:22
你醇沉时间太短了，我之前也有做过，醇沉离心后在管壁上应该能看到很小很小的沉淀，然后用水溶它，跑出来的胶条带特别亮。

好的，谢谢，我明天看看方法一的结果，不行再试方法二
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5楼2014-01-17 14:46:55
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