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杨玉焕123

木虫 (小有名气)

阳光

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[求助] 载体去磷酸化后的回收问题已有5人参与

本人用的是单酶切，自连现象很严重，需要去磷酸化，选用的是CIAP，按照说明50度反应30分钟后采用以下2种方法：
  1、PCR产物纯化试剂盒回收
  2、65度反应30分钟使酶失活，然后用等体积的酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇抽提一次，之后加入1/20倍体积5M的氯化钠和2倍体积的无水乙醇（加乙醇的时候明显能看到絮状产生），-20℃沉淀1h，13000rpm离心2min后弃上清，然后用70%的乙醇洗涤一遍，吹干后加10微升无菌去离子水溶解
各取2微升1、2所得溶液进行电泳检测，1能看到DNA条带，2没有，对二者分别进行载体的连接反应（实验组：载体、片段、T4连接酶、T4buffer，对照组：载体、T4连接酶、T4buffer）、转化实验，结果为方法1的实验组和对照组上克隆子数目都很多，挑取实验组进行质粒快抽发现都是载体自连产生的克隆。。。。方法2的实验组和对照组均没有克隆子生长。。。
  后来又做过几次方法2 ，发现方法2的去磷酸化效果挺好的，对照有10个左右克隆子，实验组片段与载体也连上了，但是由于每次去磷酸化之后载体回收后电泳都检测不到，浓度相当的低。。。，没法获得足够多的克隆子（我需要的是建立基因组文库，克隆子数目很大）。目前，正在尝试延长磷酸化反应时间，再用PCR产物纯化试剂盒回收，请问各位大侠对于方法2的DNA回收有没什么好的建议？我看到有的文献是加入1/10体积的3M醋酸钠，pH为5.2，这又是为什么呢？加盐的目的不就是为了中和电荷使DNA更容易沉淀么？跟所加盐溶液的pH没有太大的关系吧？？求指教

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1楼 2014-01-16 15:28:11

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forrestgump

新虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

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杨玉焕123(kx444555代发): 金币+4, 鼓励交流 2014-02-20 08:27:00
杨玉焕123: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-02-24 21:15:44

对于2我想说几点，毕竟我回收小RNA都成功了，还是PAGE回收，所以我有发言权，金币多多的给。
（1）我没有见过加Nacl进行促沉的，这种盐离子也很难去除，但是加醋酸钠时可以的，毕竟这个是弱酸强碱盐类，具有一定的缓冲性能。（2）-20度促沉也是对的，但是你的离心时间是否非常短，我做一般的都10min，做小RNA得高速离心半小时，你才2分钟。（3）利用酚仿抽提也会损失20-40%。（4）最后你又洗了一遍也会损失一点。所以综合因素2不见产物不足为怪。

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