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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体去磷酸化后的回收问题
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杨玉焕123

木虫 (小有名气)

阳光
引用回帖:
9楼: Originally posted by forrestgump at 2014-02-19 02:43:04
对于2我想说几点，毕竟我回收小RNA都成功了，还是PAGE回收，所以我有发言权，金币多多的给。
（1）我没有见过加Nacl进行促沉的，这种盐离子也很难去除，但是加醋酸钠时可以的，毕竟这个是弱酸强碱盐类，具有一定的 ...

那你知道为何方法一没作用么？
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11楼2014-02-24 21:17:31
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杨玉焕123

木虫 (小有名气)

阳光
引用回帖:
10楼: Originally posted by 许琼琼 at 2014-02-23 14:38:54
我想请问一下，你单酶切处理以后不进行纯化处理吗？

用胶回收试剂盒回收纯化
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12楼2014-02-24 21:18:08
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杨玉焕123

木虫 (小有名气)

阳光
引用回帖:
8楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-19 00:22:37
方法2你都看到絮状 沉淀了，居然跑胶没东西？不会是被吹跑了吧....洗和晾干都要十分小心啊。
-20℃沉淀1h完全可以省略，除了增加杂质以外没有其它效果。不过离心时间增加到5 min以上可能比较好。

呵呵，能说一下你是怎么洗和晾干么？我现在离心之后都不吸干净，然后用吹风机吹干再加水溶解
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13楼2014-02-24 21:22:26
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
★ ★
杨玉焕123: 回帖置顶 2014-02-25 11:52:33
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-25 13:01:59
引用回帖:
13楼: Originally posted by 杨玉焕123 at 2014-02-24 21:22:26
呵呵，能说一下你是怎么洗和晾干么？我现在离心之后都不吸干净，然后用吹风机吹干再加水溶解...

会不会是试剂不纯？或者污染了DNA酶什么的？我的操作和你的差不多，把完整步骤写出来吧：
1、加入1/20倍体积5M的氯化钠，加入1/10电泳buffer（主要为了带蓝色好看清分层）。
2、加入等体积氯仿充分混匀，12000rpm 3min，保留上清。
3、加入2倍体积乙醇，充分混匀，12000rpm 10min，小心吸走上清。
4、加入适量75%乙醇，12000rpm 2min，小心吸走上清，用10uL枪头在不碰到沉淀的前提下尽量吸走乙醇。
5、室温晾干，或者放37度培养箱中晾干，或者放真空泵中抽干。
6、加双蒸水溶解。
和回收率相关的关键步骤是第2步上清的保留量和第3步离心时间。然后就是注意小心不要搞丢了DNA沉淀了.
要找原因的话，建议各个步骤都取一点液体出来跑胶看看DNA的量。
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杨玉焕123
14楼2014-02-24 22:21:54
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杨玉焕123

木虫 (小有名气)

阳光
引用回帖:
14楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-24 02:21:54
会不会是试剂不纯？或者污染了DNA酶什么的？我的操作和你的差不多，把完整步骤写出来吧：
1、加入1/20倍体积5M的氯化钠，加入1/10电泳buffer（主要为了带蓝色好看清分层）。
2、加入等体积氯仿充分混匀，12000rp ...

谢谢哈，这个比较有用，我提取的DNA比较少，也就100-200ng，我用-80℃已经能回收一定量的DNA，但回收率不是很好，转化的克隆子比较少，你构建过基因文库么？
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15楼2014-02-25 11:50:55
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XOooZzz

银虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 杨玉焕123 at 2014-02-25 11:50:55
谢谢哈，这个比较有用，我提取的DNA比较少，也就100-200ng，我用-80℃已经能回收一定量的DNA，但回收率不是很好，转化的克隆子比较少，你构建过基因文库么？...

我没构建过。
不过我做的DNA比你的浓些，大约 0.5～1 ug / 20 uL，完全室温操作，加乙醇离心后有时能看到管底有很小一点点白色沉淀。
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16楼2014-02-25 12:54:42
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杨玉焕123

木虫 (小有名气)

阳光
引用回帖:
16楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-24 16:54:42
我没构建过。
不过我做的DNA比你的浓些，大约 0.5～1 ug / 20 uL，完全室温操作，加乙醇离心后有时能看到管底有很小一点点白色沉淀。...

好的，谢谢~
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17楼2014-02-25 22:54:45
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许琼琼

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 杨玉焕123 at 2014-02-24 21:18:08
用胶回收试剂盒回收纯化...

嗯，谢谢！可是胶回收浓度很低的，下面不好进行去磷酸化处理，我买的去磷酸化酶20微升体系里要加1微克的酶切产物，所以浓度特别低就没法做了。
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18楼2014-02-26 09:53:38
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杨玉焕123

木虫 (小有名气)

阳光
引用回帖:
10楼: Originally posted by 许琼琼 at 2014-02-23 14:38:54
我想请问一下，你单酶切处理以后不进行纯化处理吗？

我用胶回收试剂盒回收纯化
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19楼2014-03-04 09:37:09
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杨玉焕123

木虫 (小有名气)

阳光
送红花一朵
引用回帖:
14楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-02-24 02:21:54
会不会是试剂不纯？或者污染了DNA酶什么的？我的操作和你的差不多，把完整步骤写出来吧：
1、加入1/20倍体积5M的氯化钠，加入1/10电泳buffer（主要为了带蓝色好看清分层）。
2、加入等体积氯仿充分混匀，12000rp ...

不好意思，再打扰一下，你写的第二步中用的是氯仿？不是酚仿？还有用75%乙醇洗涤时，体积大概是多少呢？谢谢哈
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20楼2014-03-04 09:42:00
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