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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体去磷酸化后的回收问题
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
杨玉焕123: 金币+16, ★有帮助 2014-03-04 10:36:24
引用回帖:
20楼: Originally posted by 杨玉焕123 at 2014-03-04 09:42:00
不好意思，再打扰一下，你写的第二步中用的是氯仿？不是酚仿？还有用75%乙醇洗涤时，体积大概是多少呢？谢谢哈...

哦，写错了，是氯仿异戊醇。没用过酚。
我在200 uL PCR管里操作，加几十到100 uL乙醇吧。PCR管套到0.5 mL离心管再套到1.5 mL离心管里再去离心。

你这是要做载体单酶切去磷酸化吗？有些限制酶的buffer和CIP是兼容的，譬如Thermo的fast digest。我是用Thermo的快酶，20uL 体系37度酶切反应半小时后，直接加Takara的cip 0.5～1 uL，继续37度反应1小时，高温失活，跑胶回收。这样就省下一个回收步骤了。
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21楼2014-03-04 10:22:52
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杨玉焕123

木虫 (小有名气)

阳光
引用回帖:
21楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-03-03 14:22:52
哦，写错了，是氯仿异戊醇。没用过酚。
我在200 uL PCR管里操作，加几十到100 uL乙醇吧。PCR管套到0.5 mL离心管再套到1.5 mL离心管里再去离心。

你这是要做载体单酶切去磷酸化吗？有些限制酶的buffer和CIP是兼 ...

嗯，我用的是宝生物的BamH 1单酶切，载体是pet28a，酶切4-6h，酶切后有时还有环状的，所以都是切胶回收，然后用Takara的CIAP去磷酸化，再与酶切后的DNA连接、转化，谢谢你哈
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22楼2014-03-04 10:36:26
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