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XOooZzz

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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杨玉焕123: 金币+16, 有帮助 2014-03-04 10:36:24
引用回帖:
20楼: Originally posted by 杨玉焕123 at 2014-03-04 09:42:00
不好意思,再打扰一下,你写的第二步中用的是氯仿?不是酚仿?还有用75%乙醇洗涤时,体积大概是多少呢?谢谢哈...

哦,写错了,是氯仿异戊醇。没用过酚。
我在200 uL PCR管里操作,加几十到100 uL乙醇吧。PCR管套到0.5 mL离心管再套到1.5 mL离心管里再去离心。

你这是要做载体单酶切去磷酸化吗?有些限制酶的buffer和CIP是兼容的,譬如Thermo的fast digest。我是用Thermo的快酶,20uL 体系37度酶切反应半小时后,直接加Takara的cip 0.5~1 uL,继续37度反应1小时,高温失活,跑胶回收。这样就省下一个回收步骤了。
21楼2014-03-04 10:22:52
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杨玉焕123

木虫 (小有名气)

阳光

引用回帖:
21楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-03-03 14:22:52
哦,写错了,是氯仿异戊醇。没用过酚。
我在200 uL PCR管里操作,加几十到100 uL乙醇吧。PCR管套到0.5 mL离心管再套到1.5 mL离心管里再去离心。

你这是要做载体单酶切去磷酸化吗?有些限制酶的buffer和CIP是兼 ...

嗯,我用的是宝生物的BamH 1单酶切,载体是pet28a,酶切4-6h,酶切后有时还有环状的,所以都是切胶回收,然后用Takara的CIAP去磷酸化,再与酶切后的DNA连接、转化,谢谢你哈
22楼2014-03-04 10:36:26
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