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杨玉焕123木虫 (小有名气)
阳光
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[求助]
载体去磷酸化后的回收问题 已有5人参与
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本人用的是单酶切，自连现象很严重，需要去磷酸化，选用的是CIAP，按照说明50度反应30分钟后采用以下2种方法： 1、PCR产物纯化试剂盒回收 2、65度反应30分钟使酶失活，然后用等体积的酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇抽提一次，之后加入1/20倍体积5M的氯化钠和2倍体积的无水乙醇（加乙醇的时候明显能看到絮状产生），-20℃沉淀1h，13000rpm离心2min后弃上清，然后用70%的乙醇洗涤一遍，吹干后加10微升无菌去离子水溶解 各 取2微升1、2所得溶液进行电泳检测，1能看到DNA条带，2没有，对二者分别进行载体的连接反应（实验组：载体、片段、T4连接酶、T4buffer，对照组：载体、T4连接酶、T4buffer）、转化实验，结果为方法1的实验组和对照组上克隆子数目都很多，挑取实验组进行质粒快抽发现都是载体自连产生的克隆。。。。方法2的实验组和对照组均没有克隆子生长。。。 后来又做过几次方法2 ，发现方法2的去磷酸化效果挺好的，对照有10个左右克隆子，实验组片段与载体也连上了，但是由于每次去磷酸化之后载体回收后电泳都检测不到，浓度相当的低。。。，没法获得足够多的克隆子（我需要的是建立基因组文库，克隆子数目很大）。目前，正在尝试延长磷酸化反应时间，再用PCR产物纯化试剂盒回收，请问各位大侠对于方法2的DNA回收有没什么好的建议？我看到有的文献是加入1/10体积的3M醋酸钠，pH为5.2，这又是为什么呢？加盐的目的不就是为了中和电荷使DNA更容易沉淀么？跟所加盐溶液的pH没有太大的关系吧？？求指教 |
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【答案】应助回帖
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杨玉焕123: 金币+16, ★有帮助 2014-03-04 10:36:24
杨玉焕123: 金币+16, ★有帮助 2014-03-04 10:36:24
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哦，写错了，是氯仿异戊醇。没用过酚。 我在200 uL PCR管里操作，加几十到100 uL乙醇吧。PCR管套到0.5 mL离心管再套到1.5 mL离心管里再去离心。 你这是要做载体单酶切去磷酸化吗？有些限制酶的buffer和CIP是兼容的，譬如Thermo的fast digest。我是用Thermo的快酶，20uL 体系37度酶切反应半小时后，直接加Takara的cip 0.5～1 uL，继续37度反应1小时，高温失活，跑胶回收。这样就省下一个回收步骤了。 |
21楼2014-03-04 10:22:52
2楼2014-01-17 00:32:20
杨玉焕123
木虫 (小有名气)
阳光
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3楼2014-01-17 10:54:17
4楼2014-01-17 11:08:22