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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 细菌质粒提取浓度太低求助
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jsxzzxj

铜虫 (初入文坛)

[求助] 细菌质粒提取浓度太低求助已有8人参与

我质粒提取已经好几次啦，每次提取出来浓度都是很低，我这是低拷贝质粒，想提取出质粒做转化实验，求大侠指导一下并帮我分析一下为什么我提取的质粒跑电泳结果显示浓度太低？
     我曾经加大过菌量可是结果却提不出来，我的操作步骤都是严格按照天根小量中提试剂盒的说明书上来的，求高人指导下奥。
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1楼2013-12-23 15:01:39
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-12-24 08:21:05
jsxzzxj: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2013-12-24 09:25:15
gyesang: 回帖置顶 2014-03-28 16:39:44
质粒提取数量少，只是质粒拷贝数低，裂解的菌液量少或者不充分，柱子回收效率不高的问题！
    有时候按照正规操作提取质粒，也有提不出来的现象是，可能是质粒丢失了-原因不知！
    楼主可以这样：
    1对冻存的原始菌液做抗性划线培养，一来借助抗生素纯化质粒，二来也提高了菌活性液。
    2随机挑选几个单克隆扩摇，用报告基因或者启动子序列作为Pcr对象进行检测或者合适酶的酶切检测验证-可以放后面做，一般都对！
    3最大限度地提高菌体活性，先对正确的克隆小管扩摇，然后再抽取新鲜菌液再扩摇！
    4注意培养条件，培养时间不宜过长，一般8-12小时或15小时以内吧！
    5按比例加大样试剂总量，提取过程注意几个细节，比如缓慢混匀，裂解后静止等！
    6用60度左右预热的水洗脱，洗脱两遍，注意水的用量。
    7可以加多水洗脱后，利用抽真空法浓缩质粒！
    8有些盒子对质粒大小也有要求，应细看说明书！

[ 发自小木虫客户端 ]
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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
7楼2013-12-24 04:38:06
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lillian菲

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-28 16:39:28
有几个情况：
第一是你放置的菌液时间太长，质粒已经消失
第二是你最后加水溶解时加的太多，导致浓度较低
第三是你的质粒拷贝数低，有可能使菌的活化程度不够，可适当多培养几次，再提取质粒
这是我做实验的几点心得，望对你有用
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10楼2013-12-24 09:28:33
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txy8469393

木虫 (小有名气)

拿着扫把的研究僧
★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-03-28 16:41:33
gyesang: 回帖置顶 2014-03-28 16:41:35
引用回帖:
20楼: Originally posted by jsxzzxj at 2013-12-25 09:39:53
能否把溶液I，II，III和最后的洗脱液如何配置，以及实验操作步骤告知呢？静待回复，感谢。...

就是最普遍的碱法提取
溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0），加RNase。
配制方法：1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121℃高压灭菌15min ，贮存于4℃。
溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS。
配制方法：2M NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。
溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。
配制方法：5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。
苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
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找我请打110,你别看我拿着扫把,其实我是弹吉他的!
22楼2013-12-25 10:53:32
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人
引用回帖:
24楼: Originally posted by 艰苦温度 at 2014-01-16 10:30:54
最后检测浓度的时候，230的峰突出了，是什么原因你了解吗？怎么才能解决这个问题呢？求赐教。 我提了好多次，可是一直有这个问题，不知道什么原因。。。...

230峰值高表明溶液内盐离子浓度较大！
如果使用试剂盒提取的话，建议漂洗的时候适当加大离心力，漂洗两遍后要按照说明再空离心几分钟，可有效降低离子浓度。洗脱可以用自己的双蒸水，也可以启到效果！
如果是自己配置的试剂提取的，沉淀下来的产物需要用70-75%酒精漂洗，目的也是去除盐离子等杂质，然后离心沉淀，然后吸去多余酒精，风干后用超纯水溶解就是了！
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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
25楼2014-01-16 10:39:38
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普通回帖

zhl875891551

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-12-24 08:20:42
天根的效率还不错啊，你试试加大菌液，最后少加些水溶解。。
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心有多大，舞台就有多大！
2楼2013-12-23 16:23:12
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天猫天猫

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-24 08:20:49
1、采用加富的培养基摇菌，如用超级肉汤培养基或直接将LB培养基中的酵母粉和蛋白胨加倍，仔细调节培养基的初始pH值至中性或微微偏碱性；
2、培养基中添加170ug/ml氯霉素适当抑制菌体的增殖，促进质粒复制；
3、注意培养过程中的通气状态。
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3楼2013-12-23 16:39:51
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-12-24 08:20:53
多收些菌。裂解时适当增加各溶液的体积，用同一个柱子binding（多上几次）。祝好运
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4楼2013-12-24 02:18:27
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dj04164

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-12-24 08:20:56
SOC摇菌；换盒子；看看溶液B（SDS，碱）是不是时间长了；注意裂解充分。
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5楼2013-12-24 03:29:22
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txy8469393

木虫 (小有名气)

拿着扫把的研究僧

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
因为你用了试剂盒

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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找我请打110,你别看我拿着扫把,其实我是弹吉他的!
6楼2013-12-24 03:40:24
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-03-28 16:38:43
低拷贝的质粒确实 不是很好提取，所以菌液量一般是加倍的。但是菌液加倍后，相应地溶液I、II、III也应该加倍。也可以是分成两管菌来裂解，离心后上清加入到同一个纯化柱。
其实你的目的只是质粒转化，质粒转化的效率比连接产物要高，哪怕是浓度很低条带很亮，也可以先试着转化的，没必要在提取这个问题纠缠这么久
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你的日子如何，你的力量也必如何！
8楼2013-12-24 09:24:07
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jsxzzxj

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by yudaoqian88 at 2013-12-24 04:38:06
质粒提取数量少，只是质粒拷贝数低，裂解的菌液量少或者不充分，柱子回收效率不高的问题！
    有时候按照正规操作提取质粒，也有提不出来的现象是，可能是质粒丢失了-原因不知！
    楼主可以这样：
    1对冻存 ...

感谢，问题已经解决啦
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9楼2013-12-24 09:24:57
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