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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 细菌质粒提取浓度太低求助
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jsxzzxj

铜虫 (初入文坛)

[求助] 细菌质粒提取浓度太低求助已有8人参与

我质粒提取已经好几次啦，每次提取出来浓度都是很低，我这是低拷贝质粒，想提取出质粒做转化实验，求大侠指导一下并帮我分析一下为什么我提取的质粒跑电泳结果显示浓度太低？
     我曾经加大过菌量可是结果却提不出来，我的操作步骤都是严格按照天根小量中提试剂盒的说明书上来的，求高人指导下奥。
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1楼2013-12-23 15:01:39
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-12-24 08:21:05
jsxzzxj: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2013-12-24 09:25:15
gyesang: 回帖置顶 2014-03-28 16:39:44
质粒提取数量少，只是质粒拷贝数低，裂解的菌液量少或者不充分，柱子回收效率不高的问题！
    有时候按照正规操作提取质粒，也有提不出来的现象是，可能是质粒丢失了-原因不知！
    楼主可以这样：
    1对冻存的原始菌液做抗性划线培养，一来借助抗生素纯化质粒，二来也提高了菌活性液。
    2随机挑选几个单克隆扩摇，用报告基因或者启动子序列作为Pcr对象进行检测或者合适酶的酶切检测验证-可以放后面做，一般都对！
    3最大限度地提高菌体活性，先对正确的克隆小管扩摇，然后再抽取新鲜菌液再扩摇！
    4注意培养条件，培养时间不宜过长，一般8-12小时或15小时以内吧！
    5按比例加大样试剂总量，提取过程注意几个细节，比如缓慢混匀，裂解后静止等！
    6用60度左右预热的水洗脱，洗脱两遍，注意水的用量。
    7可以加多水洗脱后，利用抽真空法浓缩质粒！
    8有些盒子对质粒大小也有要求，应细看说明书！

[ 发自小木虫客户端 ]
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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
7楼2013-12-24 04:38:06
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zhl875891551

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-12-24 08:20:42
天根的效率还不错啊，你试试加大菌液，最后少加些水溶解。。
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心有多大，舞台就有多大！
2楼2013-12-23 16:23:12
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天猫天猫

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-24 08:20:49
1、采用加富的培养基摇菌，如用超级肉汤培养基或直接将LB培养基中的酵母粉和蛋白胨加倍，仔细调节培养基的初始pH值至中性或微微偏碱性；
2、培养基中添加170ug/ml氯霉素适当抑制菌体的增殖，促进质粒复制；
3、注意培养过程中的通气状态。
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3楼2013-12-23 16:39:51
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-12-24 08:20:53
多收些菌。裂解时适当增加各溶液的体积，用同一个柱子binding（多上几次）。祝好运
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4楼2013-12-24 02:18:27
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