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一路向南_J

铁虫 (初入文坛)

[求助] [求助]PCR后跑胶结果如图，请大家帮忙分析一下，谢谢各位

提取RNA后反转录获cDNA，再进行PCR，跑胶后结果如图（目的片段280左右）。marker左边是用PCR mix做的，，前三个是样品（模板量为3ul，引物1ul），第四个是质粒做阳性对照（模板量为1ul，引物1ul）；marker右边是用Taq酶做的，前三个是样品（PCR buffer2.5ul，Mg1.5ul，dNTP 0.5ul，酶0.5ul，引物为0.5ul，模板5ul），第四个是质粒做阳性对照（PCR buffer2.5ul，Mg1.5ul，dNTP 0.5ul，酶0.5ul，引物为0.5ul，模板1ul），第五个是质粒做阳性对照（PCR buffer2.5ul，Mg1.5ul，dNTP 0.5ul，酶0.5ul，引物为1ul，模板1ul）。退火温度为56度，延伸时间为45秒，30个循环。
请各位帮我分析一下，用mix做的为什么会在点样空处特别亮？用Taq酶做的那一片亮是目的条带吗？应如何改进？
谢谢各位了！！
[求助]PCR后跑胶结果如图，请大家帮忙分析一下，谢谢各位
Administrator 2013-11-04 19hr 08min.jpg
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1楼 2013-11-04 21:59:17
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-05 11:57:10
感觉模板用量太大。RNA反转录前跑胶了吗？一般反转录后的cDNA需要稀释5-10倍后取1μl为模板PCR。即使不稀释，用原液也不要3μl。是否用该cDNA为模板P其他基因，如内参？
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2楼2013-11-05 09:27:34
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一路向南_J

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-05 09:27:34
感觉模板用量太大。RNA反转录前跑胶了吗？一般反转录后的cDNA需要稀释5-10倍后取1μl为模板PCR。即使不稀释，用原液也不要3μl。是否用该cDNA为模板P其他基因，如内参？

谢谢回贴！我会减小模版的量再试一下。反转录前没跑胶，看网上说RNA跑胶易降解，没跑过，用RNA需要跑多长时间？跑出来应该是什么样的？另外，这内参指什么？没做过这个。。。还有，该PCR的退火温度需要改变吗？谢谢您的解答！
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3楼2013-11-05 21:24:47
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-06 10:25:03
引用回帖:
3楼: Originally posted by 一路向南_J at 2013-11-05 21:24:47
谢谢回贴！我会减小模版的量再试一下。反转录前没跑胶，看网上说RNA跑胶易降解，没跑过，用RNA需要跑多长时间？跑出来应该是什么样的？另外，这内参指什么？没做过这个。。。还有，该PCR的退火温度需要改变吗？谢谢 ...

跑胶可以看RNA的完整性，是否有gDNA的污染。用较高电压跑10分钟左右。跑出来的是rRNA，主要是三条带。是不是内参不重要，主要是看一个肯定表达的基因，用你的cDNA是不是能P出来，确保cDNA样品的质量。
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4楼2013-11-06 03:17:50
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一路向南_J

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-06 03:17:50
跑胶可以看RNA的完整性，是否有gDNA的污染。用较高电压跑10分钟左右。跑出来的是rRNA，主要是三条带。是不是内参不重要，主要是看一个肯定表达的基因，用你的cDNA是不是能P出来，确保cDNA样品的质量。...

好的，谢谢您的高见，我跑RNA试一下。
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5楼2013-11-07 20:09:01
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