应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » [求助]PCR后跑胶结果如图，请大家帮忙分析一下，谢谢各位
51/1返回列表
查看: 4484  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

一路向南_J

铁虫 (初入文坛)

[求助] [求助]PCR后跑胶结果如图，请大家帮忙分析一下，谢谢各位

提取RNA后反转录获cDNA，再进行PCR，跑胶后结果如图（目的片段280左右）。marker左边是用PCR mix做的，，前三个是样品（模板量为3ul，引物1ul），第四个是质粒做阳性对照（模板量为1ul，引物1ul）；marker右边是用Taq酶做的，前三个是样品（PCR buffer2.5ul，Mg1.5ul，dNTP 0.5ul，酶0.5ul，引物为0.5ul，模板5ul），第四个是质粒做阳性对照（PCR buffer2.5ul，Mg1.5ul，dNTP 0.5ul，酶0.5ul，引物为0.5ul，模板1ul），第五个是质粒做阳性对照（PCR buffer2.5ul，Mg1.5ul，dNTP 0.5ul，酶0.5ul，引物为1ul，模板1ul）。退火温度为56度，延伸时间为45秒，30个循环。
请各位帮我分析一下，用mix做的为什么会在点样空处特别亮？用Taq酶做的那一片亮是目的条带吗？应如何改进？
谢谢各位了！！
[求助]PCR后跑胶结果如图，请大家帮忙分析一下，谢谢各位
Administrator 2013-11-04 19hr 08min.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-11-04 21:59:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一路向南_J

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-05 09:27:34
感觉模板用量太大。RNA反转录前跑胶了吗？一般反转录后的cDNA需要稀释5-10倍后取1μl为模板PCR。即使不稀释，用原液也不要3μl。是否用该cDNA为模板P其他基因，如内参？

谢谢回贴！我会减小模版的量再试一下。反转录前没跑胶，看网上说RNA跑胶易降解，没跑过，用RNA需要跑多长时间？跑出来应该是什么样的？另外，这内参指什么？没做过这个。。。还有，该PCR的退火温度需要改变吗？谢谢您的解答！
赞一下 回复此楼
3楼2013-11-05 21:24:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 5 个回答

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-05 11:57:10
感觉模板用量太大。RNA反转录前跑胶了吗？一般反转录后的cDNA需要稀释5-10倍后取1μl为模板PCR。即使不稀释，用原液也不要3μl。是否用该cDNA为模板P其他基因，如内参？
赞一下 回复此楼
2楼2013-11-05 09:27:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-06 10:25:03
引用回帖:
3楼: Originally posted by 一路向南_J at 2013-11-05 21:24:47
谢谢回贴！我会减小模版的量再试一下。反转录前没跑胶，看网上说RNA跑胶易降解，没跑过，用RNA需要跑多长时间？跑出来应该是什么样的？另外，这内参指什么？没做过这个。。。还有，该PCR的退火温度需要改变吗？谢谢 ...

跑胶可以看RNA的完整性，是否有gDNA的污染。用较高电压跑10分钟左右。跑出来的是rRNA，主要是三条带。是不是内参不重要，主要是看一个肯定表达的基因，用你的cDNA是不是能P出来，确保cDNA样品的质量。
赞一下 回复此楼
4楼2013-11-06 03:17:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

一路向南_J

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-06 03:17:50
跑胶可以看RNA的完整性，是否有gDNA的污染。用较高电压跑10分钟左右。跑出来的是rRNA，主要是三条带。是不是内参不重要，主要是看一个肯定表达的基因，用你的cDNA是不是能P出来，确保cDNA样品的质量。...

好的，谢谢您的高见，我跑RNA试一下。
赞一下 回复此楼
5楼2013-11-07 20:09:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 5 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭