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jonew

木虫 (正式写手)

[求助] PCR结果分析

各路，请问哪些亮亮的拖带是怎么回事？我下一步该怎么改进？我的目的条带在2500bp ，模板是cDNA。急急急！！！！ 望各路大侠指点。。。
PCR结果分析
2013.9.26.pcr-2.jpg
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借口很贱，，，
1楼 2013-09-27 10:43:07
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zr281069

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-27 21:20:10
jonew: 金币+1 2013-09-29 22:36:27
减少镁离子的量 提高退火温度
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人物
3楼2013-09-27 17:23:16
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flyhigh805

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-30 11:08:00
引用回帖:
6楼: Originally posted by jonew at 2013-09-29 18:18:21
你的意思是把它回收后，作为模板再P？...

恩，我以前也遇见过跟你一样的问题，采用二次PCR成功的P出了目的产物。你不用回收，直接取1ul PCR产物做模板即可。
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7楼2013-09-30 08:14:19
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xiujiangfan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

有几种方案可以尝试：
1、提高退火温度5℃。
2、加入2%BSA 1μ;
3、选用MIX做，不要分布加taq,dntp
4、减少模板量，20μl体系 cDNA加入1μl足以
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10楼2013-10-01 15:16:32
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普通回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
jonew: 金币+1 2013-09-29 22:36:20
往体系里面加点5%的DMSO再PCR试试
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-09-27 17:09:49
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flyhigh805

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
jonew: 金币+2 2013-09-29 22:36:35
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-30 11:07:41
cDNA模板体积不能加太多，一般不要超过PCR体系的十分之一。另外建议尝试提高退火温度
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4楼2013-09-29 14:43:23
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flyhigh805

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
jonew: 金币+2 2013-09-29 22:36:44
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-30 11:07:49
忘了说一点，你可以尝试采用上图中的PCR产物作为模板进行二次PCR，有可能把你的目的产物p出来。
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5楼2013-09-29 14:44:46
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jonew

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by flyhigh805 at 2013-09-29 14:44:46
忘了说一点，你可以尝试采用上图中的PCR产物作为模板进行二次PCR，有可能把你的目的产物p出来。

你的意思是把它回收后，作为模板再P？
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借口很贱，，，
6楼2013-09-29 18:18:21
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白菜吃虫

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

1. 降低模板量（做个梯度，希望反转产物够）
2. 做复性温度梯度
3. 多试几种酶
4. 都没有的话，重新设计引物
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8楼2013-09-30 17:17:07
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ifyousee

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
jonew: 金币+4 2013-10-02 15:46:13
拖尾条带是非特异性扩增的产物
推荐解决措施：
重新设计退火温度相对较低一些的引物
采用热启动的Taq酶，一些国产商业化的热启动酶也都不贵的，便宜好用（国产的比如Transgen的普通热启动酶250单位也才￥180，跟Takara、Thermo比起来价钱简直弱爆了。）
采用梯度退火温度PCR，退火温度从现在的退火温度开始依次提高，每次一度，直到65度左右（注意，我指的不是touch down）
缩短退火时间
降低镁离子、减少Taq酶的量（这个说实话真没觉得有啥必要了）
以这个产物为模板再进行PCR的话也可以一试，但是按照我们的经验基本不会有结果的
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9楼2013-09-30 23:26:22
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