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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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jonew

兑换贵宾

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引用回帖:
7楼: Originally posted by flyhigh805 at 2013-09-30 08:14:19
恩,我以前也遇见过跟你一样的问题,采用二次PCR成功的P出了目的产物。你不用回收,直接取1ul PCR产物做模板即可。...

我P出来还是拖带,一样样的和以前,我下一步该怎么改进?
借口很贱,,,
11楼2013-10-05 19:11:42
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jonew

版主

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引用回帖:
5楼: Originally posted by flyhigh805 at 2013-09-29 14:44:46
忘了说一点,你可以尝试采用上图中的PCR产物作为模板进行二次PCR,有可能把你的目的产物p出来。

我重新P了 还是有拖带  只是又亮了一些  请问我下一步怎么改进?谢谢
借口很贱,,,
12楼2013-10-05 19:14:12
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凌波丽

新虫

PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的原因与对策

2013年8月23日总结(第二次修订,加上序号,使文章的层次清晰,另外修正了错漏之处)
     
    PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
    其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。

    其对策有:
  1.减少酶量(一般以2单位Taq DNA聚合酶为基点,分梯度上下调一调,其他酶也差不多如此浓度,可以参考说明书);加强DNA聚合酶的专一性或调换另一来源的专一性更好的DNA聚合酶。
  2. 增加DNA聚合酶的专一性。
(1)改用专一性更强的DNA聚合酶,或者使用两种不同的DNA聚合酶,减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时,酶量不要太大,以免出现特异性扩增。   
(2)酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油,若此操作引起酶的浓度过高,可以适当加双蒸馏水稀释。
(3)为了加强Taq DNA聚合酶的专一性。 的专一性,可在反应体系中加入:1-1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率,两者可以增加Taq DNA聚合酶的稳定性。
3.适当减少dNTP的浓度;减少dNTP的浓度一般需要与降低Mg2+浓度同方向偶联进行,但是不必按同样的比例。
4.适当降低Mg2+浓 度,可以采用梯度递减方式,以每次0.5mol/L递减,但是Mg2+的终浓度不要低于1.0mol/L。
5. 缩短PCR反应的退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物之前,不要大范围地变动反应体系的复性温度,要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增,则在引物的Tm少5-10度的范围内把PCR反应的复性温度提高1-3度。
6.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时,非特异性扩增较多,这时,最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环,退火温度降低1-2度,直至到达正常的Tm附近的退火温度。
7.采用使用专一性更强的梯度降低PCR、热启动PCR和巢式PCR。使用热启动模式。使用热启动时可以购买商用的PCR热启动酶,也可以用石蜡隔离模式。巢式PCR也有现成的试剂盒可以购买。
8. 保证PCR反应的DNA模板的质量,要用电泳检测一下分子量和纯度,质量不好则要重新提取和纯化DNA模板;适当增加DNA模板量,减少循环次数。
9.以上措施都不行时,最后就只能重新设计引物,加强引物的专一性。
13楼2013-10-07 22:03:29
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gudan000602

版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

重新设计引物吧!我之前也遇到过这种情况,各种因素都排除了,最后重新设计引物就出来了。
14楼2013-10-25 11:46:16
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