应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助PCR结果分析~~~
91/1返回列表
查看: 1530  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

xiaowo1127

铜虫 (初入文坛)

[交流] 求助PCR结果分析~~~

请问各位大侠，为什么我的PCR结果是这样的。每次P完的结果都是有两条条带，我这样的结果，应该怎样进行改正才能P出完美的结果呢，请各位高手指教~~~
这个是我的PCR条件：
预变性94℃ 5min  
30个循环 94℃ 30s、 55℃ 30s 、72℃ 30s   
最后的延伸72℃ 5min
PCR反应体系：20uL
Taq酶：0.1 uL
10*PCR buffer：2uL
dNTP：0.5uL
引物各0.5uL
DNA：0.5 uL  
剩下的用双蒸水补全
求助PCR结果分析~~~
IMG_0421111111.JPG
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2013-09-17 20:23:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yilunanxia

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-18 10:23:27
xiaowo1127: 金币+1 2013-11-06 19:43:45
最下面一行可以无视存在，当然如果楼主想要去除下面的条带的话可以尝试一下降低引物和dNTP的浓度。
赞一下 回复此楼
2楼2013-09-17 21:26:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bujunyang

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2013-09-18 10:23:35
xiaowo1127: 金币+5 2013-11-06 19:44:05
最下面的一条带一般是引物二聚体或非特异带。当你需要某个目的片段时，引物的选择是受到限制的，因此往往我们用的引物回存在形成二聚体、二级结构等很多问题。我不明白你做pcr是为了获得一个目的片段呢还是为了得到一个perfect的图片？
赞一下 回复此楼
3楼2013-09-17 21:33:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvshilu

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2013-09-18 10:23:42
你好！我的几点建议，敬请参考：
1. 调整模板的量，建议：稀释10被，100倍；或者增加1倍，2倍，5倍，10倍。你的问题是目的条带较浅，而不是后面的引物二聚体。
2. 做TM梯度，怀疑你的TM较高，但有时也说不准，实验嘛做了才知道，可以做TM梯度。
赞一下 回复此楼
5楼2013-09-18 09:29:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

renzhiq

木虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
xiaowo1127: 金币+1 2013-11-06 19:46:36
你的结果是一条带，下面的那条是引物二聚体。你要是想去除的话你适当的提升退火温度，另外你的dNTP量加少了，至少加到1.6ul。祝实验顺利！
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2013-09-18 11:17:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaowo1127

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by bujunyang at 2013-09-17 21:33:33
最下面的一条带一般是引物二聚体或非特异带。当你需要某个目的片段时，引物的选择是受到限制的，因此往往我们用的引物回存在形成二聚体、二级结构等很多问题。我不明白你做pcr是为了获得一个目的片段呢还是为了得到 ...

您好，谢谢你的回复，最好是两个都能达到，我希望目的条带能更亮一些，并且可以消除引物二聚体
赞一下 回复此楼
7楼2013-11-06 19:46:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaowo1127

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by renzhiq at 2013-09-18 11:17:22
你的结果是一条带，下面的那条是引物二聚体。你要是想去除的话你适当的提升退火温度，另外你的dNTP量加少了，至少加到1.6ul。祝实验顺利！

谢谢您，我下次做的时候试试多加点
赞一下 回复此楼
8楼2013-11-06 19:47:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiaowo1127

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lvshilu at 2013-09-18 09:29:17
你好！我的几点建议，敬请参考：
1. 调整模板的量，建议：稀释10被，100倍；或者增加1倍，2倍，5倍，10倍。你的问题是目的条带较浅，而不是后面的引物二聚体。
2. 做TM梯度，怀疑你的TM较高，但有时也说不准，实验 ...

是的，您说的很对 ，我的条带亮度确实是不够 ，我做了很多次，每次出现的问题是不一样的，我换了条件和反应的用量，可是得到的条带还是不是很满意，给您看一下，请您帮我分析一下好吗，我怎样可以把条带上面的亮度除去
反应条件 94℃  9min  预变性
            94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环
            最后在72℃延伸7min
体系20uL体系
Taq酶 为0.4μl
dNTP mixture（0.25mM）为2μl
10×PCR Buffer (Mg2+Plus)为2.5μl，
模板（土壤DNA）为5μl，
正向引物(10μM)为1μl，
反向引物（10μM）为1μl，
补全ddH2O为13.1μl
求助PCR结果分析~~~-1
IMG_7602.JPG
赞一下 回复此楼
9楼2013-11-06 19:56:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
廖志琴lzq4楼
2013-09-18 08:17   回复  
引用回帖:
3楼: Originally posted by bujunyang at 2013-09-17 21:33:33 最下面的一条带一般是引物二聚体或非特异带。当你需要某个目的片段时，引物的选择是受到限制的，因此往往我们用的引物回存在形成二聚体、二级结构等很多问题。我不明白你做pcr是为了获得一个目的片段呢还是为了得到 ...

相关版块跳转 我要订阅楼主 xiaowo1127 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭