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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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xiaowo1127

铜虫 (初入文坛)


[交流] 求助PCR结果分析~~~

请问各位大侠,为什么我的PCR结果是这样的。每次P完的结果都是有两条条带,我这样的结果,应该怎样进行改正才能P出完美的结果呢,请各位高手指教~~~
这个是我的PCR条件:
预变性94℃ 5min  
30个循环 94℃ 30s、 55℃ 30s 、72℃ 30s   
最后的延伸72℃ 5min
PCR反应体系:20uL
Taq酶:0.1 uL
10*PCR buffer:2uL
dNTP:0.5uL
引物各0.5uL
DNA:0.5 uL  
剩下的用双蒸水补全
求助PCR结果分析~~~
IMG_0421111111.JPG
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yilunanxia

金虫 (正式写手)


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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-09-18 10:23:27
xiaowo1127: 金币+1 2013-11-06 19:43:45
最下面一行可以无视存在,当然如果楼主想要去除下面的条带的话可以尝试一下降低引物和dNTP的浓度。
2楼2013-09-17 21:26:15
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bujunyang

木虫 (正式写手)


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gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流! 2013-09-18 10:23:35
xiaowo1127: 金币+5 2013-11-06 19:44:05
最下面的一条带一般是引物二聚体或非特异带。当你需要某个目的片段时,引物的选择是受到限制的,因此往往我们用的引物回存在形成二聚体、二级结构等很多问题。我不明白你做pcr是为了获得一个目的片段呢还是为了得到一个perfect的图片?
3楼2013-09-17 21:33:33
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lvshilu

新虫 (小有名气)


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gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流! 2013-09-18 10:23:42
你好!我的几点建议,敬请参考:
1. 调整模板的量,建议:稀释10被,100倍;或者增加1倍,2倍,5倍,10倍。你的问题是目的条带较浅,而不是后面的引物二聚体。
2. 做TM梯度,怀疑你的TM较高,但有时也说不准,实验嘛做了才知道,可以做TM梯度。
5楼2013-09-18 09:29:17
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renzhiq

木虫 (小有名气)


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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
xiaowo1127: 金币+1 2013-11-06 19:46:36
你的结果是一条带,下面的那条是引物二聚体。你要是想去除的话你适当的提升退火温度,另外你的dNTP量加少了,至少加到1.6ul。祝实验顺利!
6楼2013-09-18 11:17:22
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xiaowo1127

铜虫 (初入文坛)


引用回帖:
3楼: Originally posted by bujunyang at 2013-09-17 21:33:33
最下面的一条带一般是引物二聚体或非特异带。当你需要某个目的片段时,引物的选择是受到限制的,因此往往我们用的引物回存在形成二聚体、二级结构等很多问题。我不明白你做pcr是为了获得一个目的片段呢还是为了得到 ...

您好,谢谢你的回复,最好是两个都能达到,我希望目的条带能更亮一些,并且可以消除引物二聚体
7楼2013-11-06 19:46:24
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xiaowo1127

铜虫 (初入文坛)


引用回帖:
6楼: Originally posted by renzhiq at 2013-09-18 11:17:22
你的结果是一条带,下面的那条是引物二聚体。你要是想去除的话你适当的提升退火温度,另外你的dNTP量加少了,至少加到1.6ul。祝实验顺利!

谢谢您,我下次做的时候试试多加点
8楼2013-11-06 19:47:30
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xiaowo1127

铜虫 (初入文坛)


引用回帖:
5楼: Originally posted by lvshilu at 2013-09-18 09:29:17
你好!我的几点建议,敬请参考:
1. 调整模板的量,建议:稀释10被,100倍;或者增加1倍,2倍,5倍,10倍。你的问题是目的条带较浅,而不是后面的引物二聚体。
2. 做TM梯度,怀疑你的TM较高,但有时也说不准,实验 ...

是的,您说的很对 ,我的条带亮度确实是不够 ,我做了很多次,每次出现的问题是不一样的,我换了条件和反应的用量,可是得到的条带还是不是很满意,给您看一下,请您帮我分析一下好吗,我怎样可以把条带上面的亮度除去
反应条件 94℃  9min  预变性
            94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,进行30个循环
            最后在72℃延伸7min
体系20uL体系
Taq酶 为0.4μl
dNTP mixture(0.25mM)为2μl
10×PCR Buffer (Mg2+Plus)为2.5μl,
模板(土壤DNA)为5μl,
正向引物(10μM)为1μl,
反向引物(10μM)为1μl,
补全ddH2O为13.1μl
求助PCR结果分析~~~-1
IMG_7602.JPG

9楼2013-11-06 19:56:23
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简单回复
2013-09-18 08:17   回复  
引用回帖:
3楼: Originally posted by bujunyang at 2013-09-17 21:33:33 最下面的一条带一般是引物二聚体或非特异带。当你需要某个目的片段时,引物的选择是受到限制的,因此往往我们用的引物回存在形成二聚体、二级结构等很多问题。我不明白你做pcr是为了获得一个目的片段呢还是为了得到 ...

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