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冯可

新虫 (初入文坛)

[求助] SYBR green 1 real-time PCR 结果分析

这是我前两天 做real-time PCR的图。小弟第一次涉及real-time PCR 希望前辈们能够多多指点。
荧光染料：DyNAmo ColorFlash SYBR Green qPCR kit (买机器的时候带的)
机器：Piko thermo real-time PCR 仪
目的片段大小：500bp
反应体系：  thermo F-416 color flash              10μL
                    引物10μM                                     0.5μL
                    引物10μM                                     0.5μL
                    DNA模板 （OD 260/280 =1.4）  5μL
                    dd H2O                                      加到20μL
反应条件： 95 ℃ 3min
                   94 ℃  30s     53.6℃30s    72℃  30s           40个循环
           72℃ 7min
                   20℃ 永久
我有几个疑问: （图上我做的是两个重复）
1，Cq 那张图 ，扩增曲线怎么是在5-10 个循环制见出现的，而且曲线还不光滑，没看见有基线？ 正常是不是应该在15个循环以后出现扩增呢，而且15个循环之前应该是基线啊。
2，溶解曲线那张图，能看见有峰出现，但是为什么曲线不光滑呢？有很多的折线出现呢？
3，不知道这两个是不是主要原因，下一步需要怎么做呢，是应该优化引物浓度么？还是怎么回事？
4，我的阈值是 419.5 这个阈值是自动给出的。做real time的时候需要自己调节阈值么。
请前辈指教。谢谢了
SYBR green 1 real-time PCR 结果分析
Cq.png


SYBR green 1 real-time PCR 结果分析-1
溶解曲线.png
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1楼 2013-07-22 14:47:34
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wangcheng2650

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
冯可(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-23 08:52:20
模板浓度太高了，引物浓度太高了！建议降低模板跟引物浓度试试
赞一下(1人) 回复此楼
日子是混出来的！
2楼2013-07-22 21:29:16
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冯可

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wangcheng2650 at 2013-07-22 21:29:16
模板浓度太高了，引物浓度太高了！建议降低模板跟引物浓度试试

谢谢，是应该梯度稀释么？
就是反应体系加入量不变，之前将模板和引物十倍梯度稀释么？
赞一下 回复此楼
3楼2013-07-23 08:39:11
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qming82

禁虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
4楼2013-07-24 09:49:57
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taccycle

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by qming82 at 2013-07-24 09:49:57
扩增的片段有点长了，在200bp比较好；对于目的基因，一般在15个循环以后吧，溶解曲线有一个主峰就好了，说明产物比较单一，你可以在PCR后跑个胶再看一下，看看产物是否单一

楼上正解，我总结一下
1、模板浓度太高了，把模板稀释一下，建议稀释10000倍，定量体系中加入2ul模板就可以了，一般不要超过定量体系的10%，这样Ct值大概 在19左右
2、引物浓度可以，一般终浓度在0.1uM-0.5uM之间，你的引物终浓度是0.25uM完全可以
3、你扩增的片段确实有点长了，建议减少到100-300bp之间，否则会影响扩增效率
4、溶解曲线还可以，像楼上说的那样你可以跑个电泳看看，不过胶要配浓一点，比如2-3%之间的胶
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用心
5楼2013-10-17 12:27:36
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