应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SYBR green 1 real-time PCR 结果分析
51/1返回列表
查看: 2396  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

冯可

新虫 (初入文坛)

[求助] SYBR green 1 real-time PCR 结果分析

这是我前两天 做real-time PCR的图。小弟第一次涉及real-time PCR 希望前辈们能够多多指点。
荧光染料：DyNAmo ColorFlash SYBR Green qPCR kit (买机器的时候带的)
机器：Piko thermo real-time PCR 仪
目的片段大小：500bp
反应体系：  thermo F-416 color flash              10μL
                    引物10μM                                     0.5μL
                    引物10μM                                     0.5μL
                    DNA模板 （OD 260/280 =1.4）  5μL
                    dd H2O                                      加到20μL
反应条件： 95 ℃ 3min
                   94 ℃  30s     53.6℃30s    72℃  30s           40个循环
           72℃ 7min
                   20℃ 永久
我有几个疑问: （图上我做的是两个重复）
1，Cq 那张图 ，扩增曲线怎么是在5-10 个循环制见出现的，而且曲线还不光滑，没看见有基线？ 正常是不是应该在15个循环以后出现扩增呢，而且15个循环之前应该是基线啊。
2，溶解曲线那张图，能看见有峰出现，但是为什么曲线不光滑呢？有很多的折线出现呢？
3，不知道这两个是不是主要原因，下一步需要怎么做呢，是应该优化引物浓度么？还是怎么回事？
4，我的阈值是 419.5 这个阈值是自动给出的。做real time的时候需要自己调节阈值么。
请前辈指教。谢谢了
SYBR green 1 real-time PCR 结果分析
Cq.png


SYBR green 1 real-time PCR 结果分析-1
溶解曲线.png
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-07-22 14:47:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangcheng2650

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
冯可(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-23 08:52:20
模板浓度太高了，引物浓度太高了！建议降低模板跟引物浓度试试
赞一下(1人) 回复此楼
日子是混出来的！
2楼2013-07-22 21:29:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冯可

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wangcheng2650 at 2013-07-22 21:29:16
模板浓度太高了，引物浓度太高了！建议降低模板跟引物浓度试试

谢谢，是应该梯度稀释么？
就是反应体系加入量不变，之前将模板和引物十倍梯度稀释么？
赞一下 回复此楼
3楼2013-07-23 08:39:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qming82

禁虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
4楼2013-07-24 09:49:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

taccycle

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by qming82 at 2013-07-24 09:49:57
扩增的片段有点长了，在200bp比较好；对于目的基因，一般在15个循环以后吧，溶解曲线有一个主峰就好了，说明产物比较单一，你可以在PCR后跑个胶再看一下，看看产物是否单一

楼上正解，我总结一下
1、模板浓度太高了，把模板稀释一下，建议稀释10000倍，定量体系中加入2ul模板就可以了，一般不要超过定量体系的10%，这样Ct值大概 在19左右
2、引物浓度可以，一般终浓度在0.1uM-0.5uM之间，你的引物终浓度是0.25uM完全可以
3、你扩增的片段确实有点长了，建议减少到100-300bp之间，否则会影响扩增效率
4、溶解曲线还可以，像楼上说的那样你可以跑个电泳看看，不过胶要配浓一点，比如2-3%之间的胶
赞一下 回复此楼
用心
5楼2013-10-17 12:27:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 冯可 的主题更新
51/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 调剂 +8 调剂的考研学生 2026-03-09 8/400 2026-03-15 22:14 by Winj1e
[考研] 梁成伟老师课题组欢迎你的加入 +6 一鸭鸭哟 2026-03-14 7/350 2026-03-15 22:12 by Winj1e
[考博] 欢迎申博同学联系 +3 天道酬勤2026686 2026-03-10 7/350 2026-03-15 19:03 by 天道酬勤2026686
[考研] 309求调剂 +4 花与叶@ 2026-03-10 4/200 2026-03-14 21:26 by a不易
[考研] 材料与化工 323 英一+数二+物化，一志愿：哈工大 本人本科双一流 +4 自由的_飞翔 2026-03-13 5/250 2026-03-14 19:39 by hmn_wj
[考研] 中科大材料专硕319求调剂 +3 孟鑫材料 2026-03-13 3/150 2026-03-14 18:10 by houyaoxu
[考研] 材料与化工（0856）304求B区调剂 +7 邱gl 2026-03-10 11/550 2026-03-14 12:18 by 邱gl
[考研] 求调剂，药学 +3 归零lbm 2026-03-09 5/250 2026-03-14 02:21 by JourneyLucky
[考研] 279求调剂 +3 抓着星星的女孩 2026-03-10 3/150 2026-03-13 23:47 by userper
[考研] 308求调剂 +5 是Lupa啊 2026-03-11 5/250 2026-03-13 22:13 by JourneyLucky
[考研] 333求调剂 +3 球球古力 2026-03-11 3/150 2026-03-13 21:27 by JourneyLucky
[论文投稿] 投稿问题 5+4 星光灿烂xt 2026-03-12 6/300 2026-03-13 14:17 by god_tian
[考研] 268求调剂 +4 好运连绵不绝 2026-03-12 4/200 2026-03-13 10:45 by hyswxzs
[考研] 材料专硕274一志愿陕西师范大学求调剂 +4 薛云鹏 2026-03-13 4/200 2026-03-13 10:40 by 学员8dgXkO
[考研] 290求调剂 +3 ADT 2026-03-13 3/150 2026-03-13 10:19 by peike
[考研] 283求调剂，材料、化工皆可 +8 苏打水7777 2026-03-11 10/500 2026-03-13 09:06 by Linda Hu
[考研] 420求调剂 +4 莫向外求11 2026-03-10 6/300 2026-03-12 14:41 by ruiyingmiao
[考研] 0857环境调剂 +5 熠熠_11 2026-03-10 5/250 2026-03-11 10:59 by wang_dand
[考研] 294 英二数二物化 求调剂 +6 米饭团不好吃 2026-03-09 6/300 2026-03-09 23:55 by barlinike
[考研] 一志愿山东大学，总分327，英语二79，有论文，有竞赛，已过四六级 +3 木木目目1 2026-03-09 3/150 2026-03-09 19:52 by yuningshan
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭