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SYBR green 1 real-time PCR 结果分析
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这是我前两天 做real-time PCR的图。小弟第一次涉及real-time PCR 希望前辈们能够多多指点。 荧光染料：DyNAmo ColorFlash SYBR Green qPCR kit (买机器的时候带的) 机器：Piko thermo real-time PCR 仪 目的片段大小：500bp 反应体系： thermo F-416 color flash 10μL 引物10μM 0.5μL 引物10μM 0.5μL DNA模板 （OD 260/280 =1.4） 5μL dd H2O 加到20μL 反应条件： 95 ℃ 3min 94 ℃ 30s 53.6℃30s 72℃ 30s 40个循环 72℃ 7min 20℃ 永久 我有几个疑问: （图上我做的是两个重复） 1，Cq 那张图 ，扩增曲线怎么是在5-10 个循环制见出现的，而且曲线还不光滑，没看见有基线？ 正常是不是应该在15个循环以后出现扩增呢，而且15个循环之前应该是基线啊。 2，溶解曲线那张图，能看见有峰出现，但是为什么曲线不光滑呢？有很多的折线出现呢？ 3，不知道这两个是不是主要原因，下一步需要怎么做呢，是应该优化引物浓度么？还是怎么回事？ 4，我的阈值是 419.5 这个阈值是自动给出的。做real time的时候需要自己调节阈值么。 请前辈指教。谢谢了  Cq.png  溶解曲线.png |
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taccycle
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5楼2013-10-17 12:27:36