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冯可

新虫 (初入文坛)

[求助] SYBR green 1 real-time PCR 结果分析

这是我前两天 做real-time PCR的图。小弟第一次涉及real-time PCR 希望前辈们能够多多指点。
荧光染料：DyNAmo ColorFlash SYBR Green qPCR kit (买机器的时候带的)
机器：Piko thermo real-time PCR 仪
目的片段大小：500bp
反应体系：  thermo F-416 color flash              10μL
                    引物10μM                                     0.5μL
                    引物10μM                                     0.5μL
                    DNA模板 （OD 260/280 =1.4）  5μL
                    dd H2O                                      加到20μL
反应条件： 95 ℃ 3min
                   94 ℃  30s     53.6℃30s    72℃  30s           40个循环
           72℃ 7min
                   20℃ 永久
我有几个疑问: （图上我做的是两个重复）
1，Cq 那张图 ，扩增曲线怎么是在5-10 个循环制见出现的，而且曲线还不光滑，没看见有基线？ 正常是不是应该在15个循环以后出现扩增呢，而且15个循环之前应该是基线啊。
2，溶解曲线那张图，能看见有峰出现，但是为什么曲线不光滑呢？有很多的折线出现呢？
3，不知道这两个是不是主要原因，下一步需要怎么做呢，是应该优化引物浓度么？还是怎么回事？
4，我的阈值是 419.5 这个阈值是自动给出的。做real time的时候需要自己调节阈值么。
请前辈指教。谢谢了
SYBR green 1 real-time PCR 结果分析
Cq.png


SYBR green 1 real-time PCR 结果分析-1
溶解曲线.png
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1楼2013-07-22 14:47:34
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qming82

禁虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1

wangcheng2650

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
冯可(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-23 08:52:20

冯可

新虫 (初入文坛)

taccycle

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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