24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

冯可

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 29.9
帖子: 21
在线: 22.6小时
虫号: 1050397
注册: 2010-07-01
专业: 病原细菌与放线菌生物学

[求助] SYBR green 1 real-time PCR 结果分析

这是我前两天做real-time PCR的图。小弟第一次涉及real-time PCR 希望前辈们能够多多指点。
荧光染料：DyNAmo ColorFlash SYBR Green qPCR kit (买机器的时候带的)
机器：Piko thermo real-time PCR 仪
目的片段大小：500bp
反应体系：  thermo F-416 color flash             10μL
                  引物10μM                                  0.5μL
                  引物10μM                                  0.5μL
                  DNA模板（OD 260/280 =1.4）  5μL
                  dd H2O                                     加到20μL
反应条件： 95 ℃ 3min
               94 ℃  30s    53.6℃30s 72℃  30s          40个循环
         72℃ 7min
               20℃ 永久
我有几个疑问: （图上我做的是两个重复）
1，Cq 那张图，扩增曲线怎么是在5-10 个循环制见出现的，而且曲线还不光滑，没看见有基线？正常是不是应该在15个循环以后出现扩增呢，而且15个循环之前应该是基线啊。
2，溶解曲线那张图，能看见有峰出现，但是为什么曲线不光滑呢？有很多的折线出现呢？
3，不知道这两个是不是主要原因，下一步需要怎么做呢，是应该优化引物浓度么？还是怎么回事？
4，我的阈值是 419.5 这个阈值是自动给出的。做real time的时候需要自己调节阈值么。
请前辈指教。谢谢了

Cq.png