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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR出现SMEAR
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manman424

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1楼 2011-01-23 10:12:08
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★
rainwander(金币+2): 很对啊，鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-23 22:31:12
不知道你是要扩增多大长度的基因，其实一般PCR只需要改变退火温度和延伸时间即可，退火温度有时候需要设置梯度，看看在哪一个温度下扩增出来的条带最亮，楼主的是50度，怎么感觉有点低呢？下来就是延伸时间了，楼主的是1min，貌似基因很小呢？其实基因一般小于1Kb的话，1Min足以，1-2Kb的话，2min，2Kb以上就2-3min了~
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-01-23 20:54:46
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cjjsdau

木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我的情况跟你差不多，原来是出现条带，但是很浅，达不到回收的要求，于是我加倍了模板浓度，但结果更糟，目的条件直接见不到了，并且我是直接做的温度梯度。本来还想年前拿到条带去测序，这样是不可能了。还需要解决这个大问题
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拜托，我的头像不是大苍蝇，这叫松阿扁叶峰
3楼2011-01-24 09:27:40
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xiangshengyan

木虫 (正式写手)
★
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可不可以以得到的PCR为模板做一次PCR
不过如果你的片段很长 可能有较高的突变率
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ANNA&KEVIN
4楼2011-01-24 13:25:53
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manman424

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5楼2011-01-25 10:16:57
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manman424

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6楼2011-01-25 10:17:56
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天使托

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T.Shen
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Originally posted by manman424 at 2011-01-25 10:16:57:




扩增的目的片段在4700-4806之间，上下游引物设计的退火温度也就在51-53度之间，我现在就在摸索退火温度，又一次50度稍微出来点东西，但是很浅，就想着增加循环次数，但是目的片段基本还是和原来一样，拖尾 ...

延伸时间可以稍微长一些 3Min或者3.5Min 循环次数也多一些！
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7楼2011-01-25 10:54:08
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zhp1984816

铜虫 (初入文坛)
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Originally posted by manman424 at 2011-01-23 10:12:08:
我现在做PCR稍微p出来些东西，当时的条件是50度30个循环，但是目的片段很浅，于是循环次数增加到35次，但是目的条带还是不亮，反而拖尾现象严重了，请教大家该怎么摸索pcr的条件。


我现在得条件是20ul，mix1 ...

你的延伸的时间太短了，不知道你使用的是什么酶，要是普通的TAQ酶的话，其合成DNA的速度大概是1KB/30S，你有接近5K的片段，应该用2M30S的眼神时间，你延伸时间才1MIN，是肯定得不到产物的，另外，你的退火的温度太低了，一般55开始试，特异度不好，就增加退火温度，P不出条带则降低一点温度。其他的条件没必要改，30到35个循环没问题。
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相信自己的路。坚持并享受其中。
8楼2011-01-25 11:06:20
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zhp1984816

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by cjjsdau at 2011-01-24 09:27:40:
我的情况跟你差不多，原来是出现条带，但是很浅，达不到回收的要求，于是我加倍了模板浓度，但结果更糟，目的条件直接见不到了，并且我是直接做的温度梯度。本来还想年前拿到条带去测序，这样是不可能了。还需要解 ...

PCR是敏感性很高的反应，其实模板只需要100-200ng就够了。你加深模板浓度可能会P不出来产物。
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9楼2011-01-25 11:08:13
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cjjsdau

木虫 (职业作家)
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Originally posted by zhp1984816 at 2011-01-25 11:08:13:

PCR是敏感性很高的反应，其实模板只需要100-200ng就够了。你加深模板浓度可能会P不出来产物。

可是怎样确定模板浓度，一般都是反转录后直接用
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10楼2011-01-25 11:14:19
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