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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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manman424

禁虫 (初入文坛)

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zhp1984816

铜虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by manman424 at 2011-01-23 10:12:08:
我现在做PCR稍微p出来些东西,当时的条件是50度30个循环,但是目的片段很浅,于是循环次数增加到35次,但是目的条带还是不亮,反而拖尾现象严重了,请教大家该怎么摸索pcr的条件。


我现在得条件是20ul,mix1 ...

你的延伸的时间太短了,不知道你使用的是什么酶,要是普通的TAQ酶的话,其合成DNA的速度大概是1KB/30S,你有接近5K的片段,应该用2M30S的眼神时间,你延伸时间才1MIN,是肯定得不到产物的,另外,你的退火的温度太低了,一般55开始试,特异度不好,就增加退火温度,P不出条带则降低一点温度。其他的条件没必要改,30到35个循环没问题。
相信自己的路。坚持并享受其中。
8楼2011-01-25 11:06:20
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

★ ★
rainwander(金币+2): 很对啊,鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-23 22:31:12
不知道你是要扩增多大长度的基因,其实一般PCR只需要改变退火温度和延伸时间即可,退火温度有时候需要设置梯度,看看在哪一个温度下扩增出来的条带最亮,楼主的是50度,怎么感觉有点低呢?下来就是延伸时间了,楼主的是1min,貌似基因很小呢?其实基因一般小于1Kb的话,1Min足以,1-2Kb的话,2min,2Kb以上就2-3min了~
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-01-23 20:54:46
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cjjsdau

木虫 (职业作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我的情况跟你差不多,原来是出现条带,但是很浅,达不到回收的要求,于是我加倍了模板浓度,但结果更糟,目的条件直接见不到了,并且我是直接做的温度梯度。本来还想年前拿到条带去测序,这样是不可能了。还需要解决这个大问题
拜托,我的头像不是大苍蝇,这叫松阿扁叶峰
3楼2011-01-24 09:27:40
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xiangshengyan

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
可不可以以得到的PCR为模板做一次PCR
不过如果你的片段很长 可能有较高的突变率
ANNA&KEVIN
4楼2011-01-24 13:25:53
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