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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR出现SMEAR
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manman424

禁虫 (初入文坛)
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1楼 2011-01-23 10:12:08
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by manman424 at 2011-01-25 10:16:57:




扩增的目的片段在4700-4806之间，上下游引物设计的退火温度也就在51-53度之间，我现在就在摸索退火温度，又一次50度稍微出来点东西，但是很浅，就想着增加循环次数，但是目的片段基本还是和原来一样，拖尾 ...

延伸时间可以稍微长一些 3Min或者3.5Min 循环次数也多一些！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
7楼2011-01-25 10:54:08
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★
rainwander(金币+2): 很对啊，鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-23 22:31:12
不知道你是要扩增多大长度的基因，其实一般PCR只需要改变退火温度和延伸时间即可，退火温度有时候需要设置梯度，看看在哪一个温度下扩增出来的条带最亮，楼主的是50度，怎么感觉有点低呢？下来就是延伸时间了，楼主的是1min，貌似基因很小呢？其实基因一般小于1Kb的话，1Min足以，1-2Kb的话，2min，2Kb以上就2-3min了~
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-01-23 20:54:46
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cjjsdau

木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我的情况跟你差不多，原来是出现条带，但是很浅，达不到回收的要求，于是我加倍了模板浓度，但结果更糟，目的条件直接见不到了，并且我是直接做的温度梯度。本来还想年前拿到条带去测序，这样是不可能了。还需要解决这个大问题
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拜托，我的头像不是大苍蝇，这叫松阿扁叶峰
3楼2011-01-24 09:27:40
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xiangshengyan

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可不可以以得到的PCR为模板做一次PCR
不过如果你的片段很长 可能有较高的突变率
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ANNA&KEVIN
4楼2011-01-24 13:25:53
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