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夏沐浅

新虫 (小有名气)

[求助] SDS-PAGE结果求分析原因

跑的是marker蛋白，12%的分离胶，没有浓缩胶，跑着呈倒梯形，而且一共有十种蛋白的，我的出来了8条，15mA的电流，电压开始只有60V，而且83*73*1的胶跑了1：40，时间也这么长，这个是怎么回事啊？
上面的图是考染之后的，下面的是跑完之后拍的，
SDS-PAGE结果求分析原因
SDS-PAGE自制胶 zlp 2013-06-06.jpg


SDS-PAGE结果求分析原因-1
P6069319.JPG
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清浅
1楼 2013-06-07 15:52:24
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2013-06-08 08:58:42
夏沐浅: 金币+5, ★有帮助 2013-06-08 13:56:42
我觉得你的marker跑成这样算是不错的了。呈倒梯形主要可能是因为你只点了marker。如果在两边的空白泳道上点与marker同样体积的上样buffer来保持一下压力，应该可以解决这个问题。至于缺两条带的问题，问一下缺的什么分子量的带？12%的胶上对有些分子量的蛋白可能分离效果差，跑不出来的。关于电压电流的问题，你设置的是稳压还是稳流跑？如果是稳流，需要把电压调高到200V以上，刚开始的时候电压比较低，60V也算是正常的，随着电泳过程电压会逐渐升高的。跑1小时40分不是很久，根据你设置的电流，一般小胶差不多是这个时间。
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2楼2013-06-08 00:27:33
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夏沐浅

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-08 00:27:33
我觉得你的marker跑成这样算是不错的了。呈倒梯形主要可能是因为你只点了marker。如果在两边的空白泳道上点与marker同样体积的上样buffer来保持一下压力，应该可以解决这个问题。至于缺两条带的问题，问一下缺的什么 ...

缺的那两个分子量是10kd和15kd的，虽然比较小，但是其他人做的12%的胶也跑出来了。
电泳我是恒流跑的，不是正常都在200V左右，所以电压设置的是300V，开始是60V，跑完了也才100V，而且做得好的胶跑完的话大概一个小时。
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清浅
3楼2013-06-08 14:00:48
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
wizardfan: 金币+2, 谢谢进一步的帮助 2013-06-09 08:25:38
引用回帖:
3楼: Originally posted by 夏沐浅 at 2013-06-08 14:00:48
缺的那两个分子量是10kd和15kd的，虽然比较小，但是其他人做的12%的胶也跑出来了。
电泳我是恒流跑的，不是正常都在200V左右，所以电压设置的是300V，开始是60V，跑完了也才100V，而且做得好的胶跑完的话大概一个 ...

10kd的带有可能接近溴酚蓝，所以看不太到也有可能。如果不是marker的质量问题的话，应该可以看到15kda的带。总体来说你的marker其它带不错。至于电压问题，看你设的电流是多少了，如果是小胶10-15mA/gel电压应该是你说的那个范围，时间也差不多。如果想跑快一些也是可以的，有人用20-25mA跑，不过可能会产生较多热。
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4楼2013-06-08 23:51:17
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夏沐浅

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-08 23:51:17
10kd的带有可能接近溴酚蓝，所以看不太到也有可能。如果不是marker的质量问题的话，应该可以看到15kda的带。总体来说你的marker其它带不错。至于电压问题，看你设的电流是多少了，如果是小胶10-15mA/gel电压应该是 ...

mini胶，一般15mA，现在比较，现在比较纠结的是越到下边的条带越来越短，还变得很宽，条带锐度和清晰度都较低。这个怎么回事？
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清浅
5楼2013-06-09 09:35:19
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夏沐浅

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-08 23:51:17
10kd的带有可能接近溴酚蓝，所以看不太到也有可能。如果不是marker的质量问题的话，应该可以看到15kda的带。总体来说你的marker其它带不错。至于电压问题，看你设的电流是多少了，如果是小胶10-15mA/gel电压应该是 ...

而且不是因为旁边没加样的原因，
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清浅
6楼2013-06-09 09:35:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
夏沐浅: 金币+5, ★有帮助 2013-06-17 09:39:15
137167741: 金币+2, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-06-26 18:28:54
引用回帖:
5楼: Originally posted by 夏沐浅 at 2013-06-09 09:35:19
mini胶，一般15mA，现在比较，现在比较纠结的是越到下边的条带越来越短，还变得很宽，条带锐度和清晰度都较低。这个怎么回事？...

普通SDS-PAGE在小分子量区域的分辨率变差属于正常现象。而且你做的至是12%的胶，10kD以下的蛋白不太可能分开的。如果做浓度大一些的胶或者梯度胶会有所改善。如果你要分小分子量的蛋白，最好跑tricine胶。
条带从上至下有宽窄变化一般是由于样品中离子强度和渗透压的问题。如果旁边点样的话情况会好转的。
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7楼2013-06-09 11:08:00
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夏沐浅

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-09 11:08:00
普通SDS-PAGE在小分子量区域的分辨率变差属于正常现象。而且你做的至是12%的胶，10kD以下的蛋白不太可能分开的。如果做浓度大一些的胶或者梯度胶会有所改善。如果你要分小分子量的蛋白，最好跑tricine胶。
条带从 ...

旁边点样了，还是这样···
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清浅
8楼2013-06-17 09:39:34
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夏沐浅

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-09 11:08:00
普通SDS-PAGE在小分子量区域的分辨率变差属于正常现象。而且你做的至是12%的胶，10kD以下的蛋白不太可能分开的。如果做浓度大一些的胶或者梯度胶会有所改善。如果你要分小分子量的蛋白，最好跑tricine胶。
条带从 ...

做得好些的条带应该是这样的，就不知道我做的哪儿出问题了。
SDS-PAGE结果求分析原因-2
图.jpg
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清浅
9楼2013-06-17 09:41:39
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
137167741: 金币+1, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-06-26 18:29:04
引用回帖:
9楼: Originally posted by 夏沐浅 at 2013-06-17 09:41:39
做得好些的条带应该是这样的，就不知道我做的哪儿出问题了。

图.jpg
...

这个胶也有一定问题，条带从上而下有些变宽。我不知道你的marker是哪个公司的，怎么做的预处理。我是把处理好的marker稀释到与样品同样体积的loading buffer里。跑出来的带是上下一样宽。
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10楼2013-06-17 09:58:36
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