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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SDS-PAGE银染求诊断
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justdilo

木虫 (著名写手)

[交流] SDS-PAGE银染求诊断 已有5人参与

今天做了个SDS-PAGE电泳，硝酸银染色，白光反射观察，未见任何条带，甚至连Marker也没见，求大虫诊断。具体情况如下：
    材料为一禾本科植物，经提取、硫酸铵分段、Sephacryl S 400层析，分别取粗提物（A）、30%硫酸铵盐析后的上清液（B）、50%硫酸铵盐析后的沉淀（C、用dH2O溶解）、Sephacryl S 400柱层析后的收集的各峰洗脱液（D、E、F、G、H）各200uL，加1mL冷丙酮混匀，-20度放置20min，12000rpm离心15min，弃上清，沉淀在4度风干。A、B、C分别用200uL去离子水，D用20uL去离子水，E—H用40uL去离子水溶解，加入5×Loading Buffer，再加入10uL巯基乙醇混匀，煮沸5min。室温冷却后12000rpm离心10min，取20uL上清液上样。
    5%浓缩胶，恒压75V；7.5%分离胶，恒压100V，电泳结束后用去离子水漂洗，固定（400mL无水乙醇、100mL冰醋酸、加水至1L）30min；漂洗后敏化（6.8%无水乙酸钠、0.2%硫代硫酸钠、30%无水乙醇）30min，漂洗3×5min；0.25%硝酸银（现配，用前加甲醛）避光染色15min，漂洗2×15s；2.5%碳酸钠（用前加甲醛）显色6min；1.5%Na2EDTA终止。白光观察，胶上未见明显条带，Marker也没有带，仅在溴酚蓝处有一条黄褐色条带。
    其中，样品在-20度储存一周，上样前重新煮沸3min；银染时误将去离子水当作银染液加入，10min后发觉，倒出水加入银染液染色。

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我，一无所有！
1楼 2012-11-15 19:57:44
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贝壳v下了

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可能是被去离子水洗掉了，我们一般用去离子水清洗两次，但时间比较短
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专心科研
2楼2012-11-15 21:08:06
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wxlzzzz

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
去离子水是先于银染色液之前加入到胶中，没有多大影响。1、样品没有问题，因为Marker肯定得有条带，说明是染色出问题。2、纵看染色步骤，基本都是符合实验室操作的，没有多大问题。除了误加水的那一步。楼主再仔细回顾一下，保证该新鲜的试剂得新鲜配制。你的银染液里面另外添加甲醛，这点稍有出入，我以前做过，只是甲醛预先处理20 min，洗涤后加银染液处理，楼主可以试试。
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你做了什么，什么都没做。
3楼2012-11-15 23:34:16
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justdilo

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wxlzzzz at 2012-11-15 23:34:16
去离子水是先于银染色液之前加入到胶中，没有多大影响。1、样品没有问题，因为Marker肯定得有条带，说明是染色出问题。2、纵看染色步骤，基本都是符合实验室操作的，没有多大问题。除了误加水的那一步。楼主再仔细回 ...

我没大明白，你说的甲醛预处理具体怎么做？
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我，一无所有！
4楼2012-11-16 08:32:06
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你的胶厚度是多少？银染最好不要用太厚的胶，1mm的胶效果很好。此外你敏化后洗的时间太长，一般是3×15-20秒就可以了。
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5楼2012-11-16 08:51:18
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wxlzzzz

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by justdilo at 2012-11-16 08:32:06
我没大明白，你说的甲醛预处理具体怎么做？...

就是先用甲醛溶液处理，漂洗后，银染色液处理。
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你做了什么，什么都没做。
6楼2012-11-16 10:06:04
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cmin126

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
呵呵，是不是把甲醇当甲醛加了？
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7楼2012-11-17 10:49:52
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justdilo

木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cmin126 at 2012-11-17 10:49:52
呵呵，是不是把甲醇当甲醛加了？

那不会
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我，一无所有！
8楼2012-11-17 11:30:52
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dddsss2

铁杆木虫 (小有名气)
★
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固定的时间是不是有点儿短？我做的时候，最少也得一个小时
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9楼2013-10-09 20:09:37
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