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blue native ，SDS0-PAGE双向电泳
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我提取取得类囊体膜，应该加什么样品缓冲液,如何才能长期保存用于下游的blue native。跑完blue-native，再跑SDS-PAGE双向电泳银染后，胶该如何保存长期以便上质谱打点（因为上质谱需要排队，可怜呀。。。 ）。 |
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2楼2012-11-02 09:59:46
cicelyzh
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
gyfgood: 金币+5, 很好的回答！ 2012-11-02 23:33:11
swj11123: 金币+25, ★★★很有帮助, thank you 2012-11-03 11:28:13
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| 提的内囊体膜定量后分装，液氮冻，保存在-80°C，尽量不要反复冻化。做BN-PAGE时取出，冰上操作，增溶上样。双向电泳的胶短期保存在水里，当然容易污染和损坏。长期保存可以制成干胶。需要做质谱时用刀挖点，rehydrate后可以进一步蛋白酶消化上质谱。 |
3楼2012-11-02 12:14:34
4楼2012-11-03 11:32:30
cicelyzh
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5楼2012-11-04 03:34:23
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以下是我提取类囊体膜的方法，但我不知道他最终的得到的类囊体膜-80度保存前是在islation buffer 重悬保存还是直接用沉淀保存 10g叶片用ＰＢＳ缓冲液（１３７ｍＭ的ＮａＣｌ，２.７ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ３，２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ３，ＰＨ ７．４）浸洗后，剪成碎片，加入３倍体积预冷的isolation buffer（ＰＢＳ缓冲液＋３３０ｍＭ蔗糖），用预冷的杵和研钵研成匀浆。匀浆液通过两层尼龙布过滤，２０００ｇ,4°C，离心5min。弃去上清液，沉淀用isolation buffer重悬。重悬液500g，4°C离心20s,去除沉淀。上清液2000g, 4°C，离心5min.所得沉淀即为叶绿体沉淀。叶绿体沉淀重悬于isolation buffer以便进行低渗溶胀后，3000g, 4°C，离心10min以分离得到类囊体膜沉淀。得到的类囊体膜沉淀要么立即使用，或者是在液N2冷冻后分装在-80°C后备用。叶绿体含量用80%丙酮法-分光光度计法测定测定。 |
6楼2012-11-04 09:29:16
cicelyzh
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低渗溶胀缓冲液的sorbitol含量应该比较低 (一般用5mM)，isolation buffer中sorbitol是330mM, 不能胀破叶绿体吧。storage buffer中一般含有一定浓度的sorbitol或者蔗糖来维持一定的渗透压。还有就是为了维持grana stacking，需要用5-10mM MgCl2。我用的是HEPES缓冲体系，供你参考：Storage Buffer: 50 mM Hepes-KOH pH 7.5, 100 mM sorbitol, 10 mM MgCl2, [10 mM NaF]。你用的磷酸缓冲液也可以的。 此外，阴阳离子对BN胶有影响，一般先洗涤沉淀类囊体膜后重悬再增溶比较好。 |
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swj111237楼2012-11-04 10:17:55
谢谢啦 大侠 8楼2012-11-04 17:42:23
9楼2012-11-04 17:43:09
10楼2015-06-08 11:05:38
