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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 综合其他 » blue native ，SDS0-PAGE双向电泳
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swj11123

新虫 (小有名气)

[求助] blue native ，SDS0-PAGE双向电泳

我提取取得类囊体膜，应该加什么样品缓冲液,如何才能长期保存用于下游的blue native。跑完blue-native，再跑SDS-PAGE双向电泳银染后，胶该如何保存长期以便上质谱打点（因为上质谱需要排队，可怜呀。。。）。
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1楼 2012-11-02 09:36:31
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小虹

木虫 (小有名气)
顶一个
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你走在天际，看繁花满地……
2楼2012-11-02 09:59:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyfgood: 金币+5, 很好的回答！ 2012-11-02 23:33:11
swj11123: 金币+25, ★★★很有帮助, thank you 2012-11-03 11:28:13
提的内囊体膜定量后分装，液氮冻，保存在-80°C，尽量不要反复冻化。做BN-PAGE时取出，冰上操作，增溶上样。双向电泳的胶短期保存在水里，当然容易污染和损坏。长期保存可以制成干胶。需要做质谱时用刀挖点，rehydrate后可以进一步蛋白酶消化上质谱。
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3楼2012-11-02 12:14:34
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swj11123

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-02 12:14:34
提的内囊体膜定量后分装，液氮冻，保存在-80°C，尽量不要反复冻化。做BN-PAGE时取出，冰上操作，增溶上样。双向电泳的胶短期保存在水里，当然容易污染和损坏。长期保存可以制成干胶。需要做质谱时用刀挖点，rehydr ...

不好意思  我还想提的类囊提膜在分装保存前是用什么溶解的  是提取液还是别人所说的保存液（我不知道是啥），     还有干胶是怎么做的呀      我第一次做是一个cookie    可能问的问题有点傻  不要见怪
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4楼2012-11-03 11:32:30
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by swj11123 at 2012-11-03 11:32:30
不好意思  我还想提的类囊提膜在分装保存前是用什么溶解的  是提取液还是别人所说的保存液（我不知道是啥），     还有干胶是怎么做的呀      我第一次做是一个cookie    可能问的问题有点傻  不要见怪...

虽然不知道你具体怎么提的膜，一般不都是先破碎叶片，过滤，离心得到叶绿体，再用低渗的溶液shock使叶绿体破碎，然后离心，重悬。你用提类囊体膜的protocol中的storage buffer就可以了。
干胶就是把胶干燥在两层玻璃纸或者一层3MM滤纸上。先用含有乙醇和甘油的溶液让胶脱去一部分水并使其柔软，然后放在干胶机上弄干。
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5楼2012-11-04 03:34:23
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swj11123

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-04 03:34:23
虽然不知道你具体怎么提的膜，一般不都是先破碎叶片，过滤，离心得到叶绿体，再用低渗的溶液shock使叶绿体破碎，然后离心，重悬。你用提类囊体膜的protocol中的storage buffer就可以了。
干胶就是把胶干燥在两层玻 ...

以下是我提取类囊体膜的方法，但我不知道他最终的得到的类囊体膜-80度保存前是在islation buffer 重悬保存还是直接用沉淀保存
10g叶片用ＰＢＳ缓冲液（１３７ｍＭ的ＮａＣｌ，２.７ｍＭ　ＫＣｌ，１０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ３，２ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ３，ＰＨ　７．４）浸洗后，剪成碎片，加入３倍体积预冷的isolation buffer（ＰＢＳ缓冲液＋３３０ｍＭ蔗糖），用预冷的杵和研钵研成匀浆。匀浆液通过两层尼龙布过滤，２０００ｇ,4°C，离心5min。弃去上清液，沉淀用isolation buffer重悬。重悬液500g，4°C离心20s,去除沉淀。上清液2000g, 4°C，离心5min.所得沉淀即为叶绿体沉淀。叶绿体沉淀重悬于isolation buffer以便进行低渗溶胀后，3000g, 4°C，离心10min以分离得到类囊体膜沉淀。得到的类囊体膜沉淀要么立即使用，或者是在液N2冷冻后分装在-80°C后备用。叶绿体含量用80%丙酮法-分光光度计法测定测定。
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6楼2012-11-04 09:29:16
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by swj11123 at 2012-11-04 09:29:16
以下是我提取类囊体膜的方法，但我不知道他最终的得到的类囊体膜-80度保存前是在islation buffer 重悬保存还是直接用沉淀保存
10g叶片用ＰＢＳ缓冲液（１３７ｍＭ的ＮａＣｌ，２.７ｍＭ　ＫＣｌ，１０ｍＭ　Ｎａ２ ...

低渗溶胀缓冲液的sorbitol含量应该比较低 (一般用5mM)，isolation buffer中sorbitol是330mM, 不能胀破叶绿体吧。storage buffer中一般含有一定浓度的sorbitol或者蔗糖来维持一定的渗透压。还有就是为了维持grana stacking，需要用5-10mM MgCl2。我用的是HEPES缓冲体系，供你参考：Storage Buffer: 50 mM Hepes-KOH pH 7.5, 100 mM sorbitol, 10 mM MgCl2, [10 mM NaF]。你用的磷酸缓冲液也可以的。
此外，阴阳离子对BN胶有影响，一般先洗涤沉淀类囊体膜后重悬再增溶比较好。
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swj11123
7楼2012-11-04 10:17:55
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swj11123

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
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7楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-04 10:17:55
低渗溶胀缓冲液的sorbitol含量应该比较低 (一般用5mM)，isolation buffer中sorbitol是330mM, 不能胀破叶绿体吧。storage buffer中一般含有一定浓度的sorbitol或者蔗糖来维持一定的渗透压。还有就是为了维持grana s ...

谢谢啦   大侠
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8楼2012-11-04 17:42:23
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swj11123

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-04 10:17:55
低渗溶胀缓冲液的sorbitol含量应该比较低 (一般用5mM)，isolation buffer中sorbitol是330mM, 不能胀破叶绿体吧。storage buffer中一般含有一定浓度的sorbitol或者蔗糖来维持一定的渗透压。还有就是为了维持grana s ...

对我很有帮助的
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9楼2012-11-04 17:43:09
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绛依

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-02 12:14:34
提的内囊体膜定量后分装，液氮冻，保存在-80°C，尽量不要反复冻化。做BN-PAGE时取出，冰上操作，增溶上样。双向电泳的胶短期保存在水里，当然容易污染和损坏。长期保存可以制成干胶。需要做质谱时用刀挖点，rehydr ...

楼主好厉害，如果有抑制剂结合在复合物上，能不能在BN-PAGE上跑出来，上质谱能不能从质谱上看出抑制剂结合在复合物上了呢？
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10楼2015-06-08 11:05:38
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