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电泳Marker分子量的归属问题 已有1人参与
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蛋白样品为Aβ1-42，单体分子量为4.5 KD。 凝胶用的是Tricine-SDS-PAGE，三层胶，厚度1.5 mm，自己配的。 （图1）电泳条件是70V，跑了大约15h，怕时间久了温度太高，所以用了冰浴。 显色方案是银染，用的碧云天的快速银染试剂盒，显色时间大概在10 min左右。 Marker用的分别是Thermo的26616和26632（图2）：其中26616是预染的，我用它来观察蛋白泳动的情况，标注的分子量应该没问题，染色前70 KD的条带是红色的，10 KD的条带是绿色的；26632是非预染的。 问题是26632指示的分子量该怎么对照： 1、如果按（图1）中（1）标注的，10、15、25 KD的条带跟26616的能对上，但是3.4和5 KD的条带不见了，是什么原因造成的？ （（图3）是猜想它俩跑出去了，换了1 mm厚度的胶来跑，70 V，4 .5h，好像下面也干干净净的，啥都没有）。 2、如果按（图1）中（2）标注的，从下往上依次标注，要怎么解释两种marker指示的分子量差别那么大？ 之前没怎么接触过电泳，最近才开始做，重复了好多次，都是差不多的结果，很困惑。请大家给咱指导一下，先谢谢了！  P50710-222121_副本_副本.jpg  P50722-145623_副本.jpg  P50715-195720_副本.jpg |
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2楼2015-07-23 08:40:05
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我后来发现是我的负极buffer配错了，才跑不动。换了正确的跑，70V跑到夹层胶，再换120V跑到底，一共用了3个多小时。 第二块胶背景深是因为试剂盒里的银溶液用光了，就用了别人配的。平常我用乙醇：醋酸：水=50：10：40固定过夜后，用试剂盒染出来的背景是很浅的。 我现在在摸孵育的时间，文献上的孵育时间只能做参考。打算加了F12后4度孵育，在不同时间点取样，不离心，直接变性，看看它们的分子量分布，再决定下一步怎么处理它。 你说的啥都没有，我没遇到过，我之前即使是buffer配错了，也是有条带的。等我结果出来了以后，在接着讨论吧。寡聚体不好做，共勉！ 发自小木虫Android客户端 |
5楼2015-09-15 14:42:24
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不知道你参考的孵育方法是否跟我一样，我参考的是W.L.Klein的方法。看了一篇14年的文章，他实验室验证自己的方法，可以得到80kDa的球形寡聚体。你再做的时候，可以考虑一下这个情况，因为我用三层胶跑的时候，感觉70kDa往上的条带，都不怎么跑得进分离胶里来。 发自小木虫Android客户端 |
6楼2015-09-16 09:04:51
