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关于SDS-PAGE出现的问题 已有2人参与
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我跑的是SDS-PAGE电泳，浓缩胶5%，分离胶12.5%跑质膜蛋白，我用的是银染的方法。上一次也是用同样的方法试剂，蛋白质就跑下来了，但是这一次蛋白质样品卡在浓缩胶与分离胶之间下不来，不知道是什么原因，请各位指点一下，谢谢 20140925_175807.jpg |
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zhqingfang
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2楼2014-09-27 09:22:38
3楼2015-09-26 22:23:08
【答案】应助回帖
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1.装板 将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠，将两块玻璃立起来使底端接触桌面，用手将两块玻璃夹住放入电泳槽内，然后插入斜插板到适中程度, 即可灌胶。 2. 凝胶的聚合 分离胶和浓缩胶的制备：按下表中溶液的顺序及比例，配置10%的分离胶和4.8%的浓缩胶。 试剂名称 10%的分离胶/mL 4.8%的浓缩胶/mL Acr/Bis 30% 分离胶缓冲液（pH8.9） 浓缩胶缓冲液（pH6.8） 10%SDS 10%过硫酸铵 水 TEMED 5 3.75 0 0.15 0.1 5 1 1.6 0 1.25 0.1 0.1 4.95 1 按上表各液加入混匀后配制成分离胶后，将凝胶液沿凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓用滴管滴入，小心不要产生气泡。将胶液加到距短玻璃板上沿2cm处为止,约5mL。然后用细滴管或注射器仔细注入少量水,约0.5-1mL。室温放置聚合30-40min。待分离胶聚合后，用滤纸条轻轻吸去分离胶表面的水分，按上表制备浓缩胶。用长滴管小心加到分离胶的上面，插入样品模子(梳子);待浓缩胶聚合后，小心拔出样品模子。 3.蛋白质样品的处理 若标准蛋白质或欲分离的蛋白质样品是固体，称取lmg的样品溶解于lmL 0.5mol/L pH6.8Tris-盐酸缓冲液或蒸馏水中;若样品是液体，要测定蛋白质浓度，按1.0～1.5mg/mL溶液比例，取蛋白质样液与样品处理液等体积混匀。本实验所用样品为15～20mg的标准蛋白样品溶液，放置在0.5mL的离心管中，加入15—20ml的样品处理液。在100℃水浴中处理2min，冷却至室温后备用。吸取未知分子量的蛋白质样品20ml，按照标准蛋白的处理方法进行处理。 4.加样 SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳的加样方法： 用手夹住两块玻璃板,上提斜插板使其松开,然后取下玻璃胶室去掉密封用硅胶框,注意在上述过程中手始终给玻璃胶室一个夹紧力,再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽,插入斜板,将缓冲液加至内槽玻璃凹面以上,外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿3mm处即可,注意避免在电泳槽内出现气泡。 加样时可用加样器斜靠在提手边缘的凹槽内，以准确定位加样位置，或用微量注射器依次在各样品槽内加样，各加10～15ml(含蛋白质10～15mg)，稀溶液可加20～30ml (还要根据胶的厚度灵活掌握)。 5.电泳 加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电流控制在15～20mA，大约15～20min;样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电流升到30～45mA，电泳过程保持电流稳定。当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1～2cm处即停止电泳，约1-2小时。如室温高，打开电泳槽循环水，降低电泳温度。 6.染色、脱色 电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心插入铜丝作为标志，放入大培养皿中染色，使用0.25%的考马斯亮蓝染液，染色2～4h，必要时可过夜。弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经常换脱色液，直至蛋白质带清晰为止。 7.结果处理 1)测量脱色后凝胶板的长度和每个蛋白质样品移动距离(即蛋白质带中心到加样孔的距离)，测量指示染料迁移的距离。 2)按以下公式计算蛋白质样品的相对迁移率(Rm) 相对迁移率=样品迁移距离(cm)/染料迁移距离(cm) 3)标准曲线的制作：以各标准蛋白质相对迁移率为横坐标，蛋白质分子量的对数为纵坐标在半对数坐标纸上做图，得到一条标准曲线。 4)测定蛋白质样品的分子量：根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查得该蛋白质的分子量。英格恩生物 |
4楼2015-09-29 09:49:21
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