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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SDS-PAGE的问题请教，大家帮帮忙啊！求高手啊！
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ruililian09

银虫 (小有名气)

[求助] SDS-PAGE的问题请教，大家帮帮忙啊！求高手啊！

我跑过好多次蛋白电泳，但是都不太理想，总是会遇到各种突发状况，例如分离胶和浓缩胶不凝(10%AP是现配的，12.5mL分离胶中加40微升，TEMED10微升；5.5mL体系浓缩胶中AP和TEMED各加10微升)，后来我加大了TEMED的量，胶能成形了；
但最近又碰到问题了，我用伯乐的电泳仪15mA恒流跑浓缩胶(两块胶)，大概45min还算正常(稍微久了点)，30mA跑分离胶40分钟溴酚蓝就跑出了(以前要一个多小时)，但是染色发现我的蛋白样品才跑到一半还没有完全分开，Marker也集中在前半段，不知道是什么原因。
难道是溴酚蓝出问题了，怎么比我的样品快那么多，还是说我的分离胶有问题？以前从来没有出现过这种情况。
另外还想请教一下，电流和胶的块数有关系吗？4块胶电流需要翻倍吗？
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1楼 2013-03-16 19:43:49
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉是你的分离胶的问题。测下配分离胶的tris pH。此外还有可能是丙烯酰胺的问题，溶液是自己配的吗？胶不好凝和不正常带型有可能是丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺的比例不对。
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2楼2013-03-17 01:06:19
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alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
电压呢？
你的配方是分子克隆的吗？
换下别人用过的试剂，以前我们遇到过假试剂
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修身、齐家、治国、平天下
3楼2013-03-17 08:12:24
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shsDerek

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉你的TEMED有问题，同时配胶时有可能没有充分混匀，电泳液加的够吗
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4楼2013-03-17 10:19:03
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王文钊-

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
额，我们跑蛋白胶的时候，电压一般是先80，再150，要不你试试变变电压？还有，如果试剂配的时间久了 ，就都换换吧~
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5楼2013-03-17 14:31:59
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porphybaby

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我觉得pH出问题的可能性比较大。pH变化了然后导致那些蛋白就都跑不动了。

还有你也有可能是胶凝得不均匀 有的地方太密了 有的又太疏了 可能会 这样。
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7楼2013-03-17 20:15:34
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普通回帖

ruililian09

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 王文钊- at 2013-03-17 14:31:59
额，我们跑蛋白胶的时候，电压一般是先80，再150，要不你试试变变电压？还有，如果试剂配的时间久了 ，就都换换吧~

试剂是刚配的，每次电泳都有问题，真是纠结死了
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6楼2013-03-17 15:09:35
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fuding6

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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gyesang: 金币+1, 鼓励应助！ 2013-03-17 21:43:25
10%AP少了点吧，12.5ml分离胶应该要120ul的10% AP，要不然交联度不够，所以就会出现意外情况。
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8楼2013-03-17 21:35:41
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的配方好像有问题，12.5ml的分离胶应加125ul的10% AP，TEMED可减少至4ul
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
9楼2013-03-17 21:44:30
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lhazrael

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
电流小了吧，好久不做了，我记得，胶板之间是并联的，多一块应该翻倍的
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10楼2013-03-18 08:55:43
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