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mengfei2050

铜虫 (正式写手)

[求助] SDS-PAGE 我的样品没有跑出条带，请教高手！谢谢！

我从sigma买的脂肪酶pfl，昨天做了SDS-PAGE,电泳的结果是marker和其他人的发酵液提取的蛋白都有条带，就我的样一条也没跑出来。
我对样品的处理方法是：
用缓冲溶液配制酶的溶液，酶浓度0.001--5 mg/mL一共五六个浓度。
上样的时候直接10uL酶溶液加10uL巯基乙醇混合。
求原因。
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comeon
1楼 2011-07-16 11:47:56
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cxj.nt

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-07-16 20:28:08
应该先配上样缓冲液吧，5ml的5×SDS-PAGE的配方：1mol/l  Tirs-HCl(PH6.8) 1.25ml，SDS  0.5g，甘油   2.5ml，溴酚兰 25mg，加去离子水溶解定容至5ml，每份500微升分装后室温保存，使用前将25微升的2-ME加到每小分中。
样品跟上样缓冲液按4:1混合后，沸水煮5min再上样
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2楼2011-07-16 15:39:41
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子曰包子好吃

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-07-16 20:28:14
mengfei2050(金币+3): 2011-07-18 08:44:12
你的蛋白变性了没啊？先跟上样缓冲液混匀 煮沸5min 或者97℃ 5min 变性
-20℃或-80℃保存 下次上样前95℃ 5秒 再充分混匀上样
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3楼2011-07-16 15:49:40
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mengfei2050

铜虫 (正式写手)
我的样品没有煮沸，不煮沸有什么影响吗？
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comeon
4楼2011-07-16 16:14:57
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cxj.nt

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

mengfei2050(金币+7): 2011-07-18 08:44:00
煮沸是变性的，你是不是样品放时间长了？我以前也有煮了过几天在跑就跑不出来的
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5楼2011-07-16 17:15:18
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tomorrowhl

新虫 (初入文坛)
我用细菌胞外产物跑PAGE，要不是没有条带，要不是模糊的条带，maker和样品的泳道挨着就会被及变形，样品的泳道很宽，差不多是两个用到那么款。用考马斯亮蓝测定蛋白质含量为1.78mg/ml。在电泳时会看到有黄色物质从样品泳道中析出。请各位高手指点迷津，小女子不胜感激啊！！！！
我的浓缩胶浓度为12，实验室其他人和我同时跑都能跑出清晰的条带
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6楼2012-05-15 16:04:15
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chunqizzm

银虫 (小有名气)
引用回帖:
1615185楼: Originally posted by tomorrowhl at 2012-05-15 16:04:15:
我用细菌胞外产物跑PAGE，要不是没有条带，要不是模糊的条带，maker和样品的泳道挨着就会被及变形，样品的泳道很宽，差不多是两个用到那么款。用考马斯亮蓝测定蛋白质含量为1.78mg/ml。在电泳时会看到有黄色物质从 ...

最好是上传一下图片！
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7楼2012-05-15 21:50:02
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chunqizzm

银虫 (小有名气)
引用回帖:
1615185楼: Originally posted by tomorrowhl at 2012-05-15 16:04:15:
我用细菌胞外产物跑PAGE，要不是没有条带，要不是模糊的条带，maker和样品的泳道挨着就会被及变形，样品的泳道很宽，差不多是两个用到那么款。用考马斯亮蓝测定蛋白质含量为1.78mg/ml。在电泳时会看到有黄色物质从 ...

有一种可能是样品pH值的问题。没见着图我真不知道能怎么说，我也没多少经验。希望有大神解答。最好是上传图片看看，毕竟电泳最后得到的就是图。
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8楼2012-05-15 21:53:44
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