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zhuyanran

铁虫 (初入文坛)

[求助] 关于tricine-sds-page的一些问题

我在跑小分子多肽电泳时,有几个问题想请大家给指导一下
(1)在浓缩胶和夹层胶条带都是压成一条线的,可是一进分离胶就扩散的很严重
(2)我的样品为什么在loading buffer里溶解后loading buffer和样品分层呢,上样时有白色沉淀
(3)现在marker跑的挺好的,可是样品死活跑不出来,而且分离胶扩散很严重
希望高手指点一二,谢谢啦!
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-11-27 13:29:50
zhuyanran: 金币+5, 有帮助, 希望多多指导,还有很多要请教的,谢谢了! 2013-11-27 20:40:55
1. 你指溴酚蓝前沿扩散吗?
2. 怀疑你的样品本身含有一些成分,与SDS发生沉淀。你的样品是怎样提取的,有什么特殊试剂?
3. marker好说嘛胶没有问题。是样品本身的问题。我觉得你样品制备本身可能用了一些不相容的试剂。
2楼2013-11-27 12:46:34
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zhuyanran

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-27 12:46:34
1. 你指溴酚蓝前沿扩散吗?
2. 怀疑你的样品本身含有一些成分,与SDS发生沉淀。你的样品是怎样提取的,有什么特殊试剂?
3. marker好说嘛胶没有问题。是样品本身的问题。我觉得你样品制备本身可能用了一些不相容的 ...

您好,我用的loading buffer是G-250, 我的样品是微生物的胞外产物,我就用Nacl 离子交换纯化和水过分子筛纯化做的,没有用什么特殊的试剂,我用的loading buffer是参照2006年的tricine- sds-page来做的,配方是12%SDS,6%巯基乙醇,30%甘油,0.05%G-250,150mM Tris-cl, pH 6.8. 不知道这是不是有什么问题。在浓缩胶和夹层胶压缩的特别好,但是一进分离胶就扩散的很严重。
3楼2013-11-27 14:39:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
3楼: Originally posted by zhuyanran at 2013-11-27 14:39:32
您好,我用的loading buffer是G-250, 我的样品是微生物的胞外产物,我就用Nacl 离子交换纯化和水过分子筛纯化做的,没有用什么特殊的试剂,我用的loading buffer是参照2006年的tricine- sds-page来做的,配方是12 ...

你的loading buffer应该没有什么问题。样品的离子强度大对PAGE的影响很大,比方说含有较高浓度的盐或者磷酸根。如果marker没有问题,只能是样品的事情了。检查一下你的样品最终的buffer成分。
4楼2013-11-28 00:25:49
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zhuyanran

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-28 00:25:49
你的loading buffer应该没有什么问题。样品的离子强度大对PAGE的影响很大,比方说含有较高浓度的盐或者磷酸根。如果marker没有问题,只能是样品的事情了。检查一下你的样品最终的buffer成分。...

里面就是含有较高的nacl,但是分子量太小和盐分不开,反正是一溶解就有沉淀,而且也跑不出来条带。应该是没有磷酸根的。您有没有什么好的建议来除盐呢?
5楼2013-11-28 13:51:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
5楼: Originally posted by zhuyanran at 2013-11-28 13:51:52
里面就是含有较高的nacl,但是分子量太小和盐分不开,反正是一溶解就有沉淀,而且也跑不出来条带。应该是没有磷酸根的。您有没有什么好的建议来除盐呢?...

可以过脱盐柱或者透析。
6楼2013-11-28 17:02:23
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zhuyanran

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-28 17:02:23
可以过脱盐柱或者透析。...

我用100-500的透析袋透析两个小时盐没除掉,但是我的样品已经没有活性了,我用多肽柱分离纯化的,但是没有和盐分开。所以我很郁闷,现在跑不出来条带就很着急,是不是哪个过程我出问题了?
7楼2013-11-28 21:42:14
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
7楼: Originally posted by zhuyanran at 2013-11-28 21:42:14
我用100-500的透析袋透析两个小时盐没除掉,但是我的样品已经没有活性了,我用多肽柱分离纯化的,但是没有和盐分开。所以我很郁闷,现在跑不出来条带就很着急,是不是哪个过程我出问题了?...

透析除盐时间长短与透析方式、透析液量的多少有关。你要的酶活是否要结合辅助因子?有可能透析时辅助因子掉了。如果你只是为了跑变性电泳,是否有活性问题不大。如果你要活性样品,可能需要在透析液液中加入辅助因子或者透析完再加入重新结合。
8楼2013-11-29 01:26:04
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