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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】急！有木有做过Tricine－SDS－PAGE小分子蛋白电泳的进！
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woaipan

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助】急！有木有做过Tricine－SDS－PAGE小分子蛋白电泳的进！

我最近在纯化蛋白，估计纯化得到的蛋白分子量挺小的，低于10kD，想用tricine－sds-page电泳跑一下看看，但是查了资料这种电泳需配置阴极和阳极两种电泳缓冲液，我照着说明配好了，现在不知道如何使用，具体怎么加到电泳槽中。以前做sds-page的时候只需要加一种电泳缓冲液，所以糊涂了。
注：文献中说是阳极电泳液加到底部，阴极的则加在上部。
亟待各位大虾的帮助和解决！
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1楼 2011-04-16 15:42:11
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静静秋

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
silicare: 金币+5, BioEPI+1, 应助指数+1, 鼓励新虫发帖交流 2013-05-27 10:53:03
我最近在做Tricine胶，和普通胶的区别在于胶的配置方法不同，还有就是需要用阴阳两极缓冲液。可以先用低电压跑30min，然后再用正常电压跑完，注意控制温度，最好放在4℃的冷冻柜里面跑，效果会更好。
染色液和脱色液可以用普通胶的染色液和脱色液，染色和脱色时间不要过长了，染色之前一定要用固定液进行固定，以防小分子弥散了，染色液有很多中，我用的是乙酸铵，楼主可以试试，我跑出来了，条带很清晰
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softcheese
16楼2013-05-27 10:10:51
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lys0704

银虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
woaipan(金币+1): 2011-04-27 11:36:04
内槽为阴极缓冲液，外槽为阳极缓冲液
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6楼2011-04-24 21:33:08
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
二楼的方法我也用过，可以很好的分离4kD的小蛋白。其实10kD的蛋白不一定用tricine胶。可以自己做个12-21%的梯度胶，或者胶里加加6M尿素。至于什么阳极阴极缓冲液，你只要把阴极缓冲液加在上槽（和胶的样品孔相连），阳极缓冲液加在下槽即可。
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13楼2012-09-24 15:06:46
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xifu521

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
就是一般的槽 上面装入阴极溶液 下面装入阳极溶液 电泳的时候阴极往阳极跑 我觉得是这样的
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7楼2012-03-29 11:00:10
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木虫懒

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
准备电泳时，在电泳槽底部加入正极缓冲液，将制好的胶连同其装置放入电泳槽内，在两块胶之间注入负极缓冲液。
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14楼2012-12-04 15:51:30
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protein780

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by 静静秋 at 2013-05-27 10:10:51
我最近在做Tricine胶，和普通胶的区别在于胶的配置方法不同，还有就是需要用阴阳两极缓冲液。可以先用低电压跑30min，然后再用正常电压跑完，注意控制温度，最好放在4℃的冷冻柜里面跑，效果会更好。
染色液和脱色 ...

我跑的Tricine胶10KD以下看不到东西，你的能看清楚吗？
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17楼2013-07-02 09:29:07
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protein780

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-09-24 15:06:46
二楼的方法我也用过，可以很好的分离4kD的小蛋白。其实10kD的蛋白不一定用tricine胶。可以自己做个12-21%的梯度胶，或者胶里加加6M尿素。至于什么阳极阴极缓冲液，你只要把阴极缓冲液加在上槽（和胶的样品孔相连）， ...

你好，我用文献查到的方法配制了tricine胶，也配制了阴阳极缓冲液，并且按照要求的方法跑的，只是染胶的时候直接考染的，然后煮大概20分钟脱色，结果是10KD以下没有蛋白，好奇怪，菌液也是都没有，能帮忙分析下原因吗？
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18楼2013-07-02 09:39:10
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protein780

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by 静静秋 at 2013-05-27 10:10:51
我最近在做Tricine胶，和普通胶的区别在于胶的配置方法不同，还有就是需要用阴阳两极缓冲液。可以先用低电压跑30min，然后再用正常电压跑完，注意控制温度，最好放在4℃的冷冻柜里面跑，效果会更好。
染色液和脱色 ...

你好，是将胶直接泡在乙酸铵里吗？浓度多少？时间呢？我用文献查到的方法配制了tricine胶，并且按照要求的方法跑的，只是染胶的时候直接考染的，然后煮大概20分钟脱色，结果是10KD以下没有蛋白，好奇怪，菌液也是都没有，能帮忙分析下原因吗？
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19楼2013-07-02 09:44:30
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静静秋

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
17楼: Originally posted by protein780 at 2013-07-02 09:29:07
我跑的Tricine胶10KD以下看不到东西，你的能看清楚吗？...

能的，基本上3-10KDa的都能看见，比较清晰
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22楼2013-07-04 23:32:43
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静静秋

木虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by protein780 at 2013-07-02 09:39:10
你好，我用文献查到的方法配制了tricine胶，也配制了阴阳极缓冲液，并且按照要求的方法跑的，只是染胶的时候直接考染的，然后煮大概20分钟脱色，结果是10KD以下没有蛋白，好奇怪，菌液也是都没有，能帮忙分析下原因 ...

有没有用固定液呢？小分子胶最好先用一下固定液在进行考染，如果不固定，小分子容易弥散。
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23楼2013-07-04 23:34:05
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静静秋

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
19楼: Originally posted by protein780 at 2013-07-02 09:44:30
你好，是将胶直接泡在乙酸铵里吗？浓度多少？时间呢？我用文献查到的方法配制了tricine胶，并且按照要求的方法跑的，只是染胶的时候直接考染的，然后煮大概20分钟脱色，结果是10KD以下没有蛋白，好奇怪，菌液也是都 ...

我用的固定液是乙醇：醋酸：水=40:10:50，然后加入100mM的乙酸铵，放在固定液中摇动20-30min就可以了，然后再用水洗干净进行考染，染色的时候可以在50℃的水浴中，我一般是30min染色，20min脱色，然后用水把背景色透干净。
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24楼2013-07-04 23:37:42
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静静秋

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
21楼: Originally posted by 小小米呐 at 2013-07-03 20:40:03
可不是上槽的缓冲液会通过缝隙流到下槽吗？...

我在电泳的时候也会出现上槽液流入下槽的现象，其实两者的pH等很接近，区别在于上槽中有Tricine，是一个非连续性的缓冲溶液，有少量的渗入没有多大的影响，并不会影响电泳结果，但是因为电泳时间很长，所以要注意添加上槽电极缓冲液。
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26楼2013-07-04 23:41:47
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
29楼: Originally posted by 苏州生健 at 2013-11-26 17:02:45
请问12%-21%的梯度胶怎么配，还有6M尿素在凝胶中的具体作用是什么？谢谢...

分别配12%和21%的胶，21%的胶里有12.5%的蔗糖或者20%的甘油，用一个gradient mixer。尿素对于小分子蛋白特别是膜蛋白的分离比较好，下半部分的胶的分辨率会更高。
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30楼2013-11-27 00:57:27
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普通回帖

woaipan

铜虫 (初入文坛)
，自己先顶一个，怎么木有人啊～，救命啊
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2楼2011-04-16 15:49:16
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mamadexiao

木虫 (正式写手)
woaipan(金币+1): 2011-04-18 15:50:58
我觉得是不是那种中型胶板阿,上下各自装缓冲液的那种
另外,用TRICINE配的胶似乎也可以在一般的缓冲液里跑啊...
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3楼2011-04-16 18:13:37
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woaipan

铜虫 (初入文坛)
貌似如果用一般的缓冲液电泳系统还是连续的，tricine好像就是不连续的电泳体系，所以好像必须得用阴阳极的缓冲液！
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4楼2011-04-16 19:12:58
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rhy1027

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
silicare(金币+2, EPI+1): 谢谢参与 2011-04-18 18:30:34
我跑过Trcine-SDS-PAGE.我的蛋白3.5KD。其实你不一定需要配阴极阳极液，直接配3层梯度胶就可以，running buffer 加大离子强度，然后再冰上跑就没问题了！当然如果钱不是问题的话，更简单，买Invitrogen的4-16%梯度分离胶，效果也不错的！
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5楼2011-04-18 17:36:47
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cicilyok

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主，请问你在配置3C/6C储备液的时候有没有遇到不溶现象，以及过滤速度极慢的问题？怎么解决的呢，求赐教
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8楼2012-04-08 20:53:52
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xifu521

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1257363楼: Originally posted by cicilyok at 2012-04-08 20:53:52:
楼主，请问你在配置3C/6C储备液的时候有没有遇到不溶现象，以及过滤速度极慢的问题？怎么解决的呢，求赐教

我遇到过，一晚上都没有溶解，可以在稍微高一点的温度中水浴一下，立即就溶解了。我当时用的是40摄氏度，你可以低一点，而且要快，不会影响成胶。过滤慢的话只能勤换滤纸，没有别的办法了，看一下是不是没有溶解完全导致的过滤慢。
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9楼2012-04-10 18:07:54
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清风散人

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
927462楼: Originally posted by rhy1027 at 2011-04-18 17:36:47
我跑过Trcine-SDS-PAGE.我的蛋白3.5KD。其实你不一定需要配阴极阳极液，直接配3层梯度胶就可以，running buffer 加大离子强度，然后再冰上跑就没问题了！当然如果钱不是问题的话，更简单，买Invitrogen的4-16%梯度分 ...

你好。我有点不明白，trcine的与普通的区别就是电极缓冲液不一样吗？
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10楼2012-08-06 21:48:09
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zkydc810307

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
建议用HPLC，tricine光跑胶就至少要跑6h以上，还不算染色脱色，非常的麻烦
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11楼2012-08-08 17:49:18
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丫头7976

铜虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你好 我问一下 tricine SDS-PAGE的胶是梯度的吗
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12楼2012-09-21 20:38:16
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chu_81

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
还是按照成功的先例来吧
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15楼2013-01-18 08:41:20
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小小米呐

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicilyok at 2012-04-08 20:53:52
楼主，请问你在配置3C/6C储备液的时候有没有遇到不溶现象，以及过滤速度极慢的问题？怎么解决的呢，求赐教

请问3C/6C是什么呀，我今天配的Acr和Bis就一直不溶，超声波震荡仪也没效？急急急
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20楼2013-07-03 20:35:54
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小小米呐

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by 木虫懒 at 2012-12-04 15:51:30
准备电泳时，在电泳槽底部加入正极缓冲液，将制好的胶连同其装置放入电泳槽内，在两块胶之间注入负极缓冲液。

可不是上槽的缓冲液会通过缝隙流到下槽吗？
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21楼2013-07-03 20:40:03
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静静秋

木虫 (正式写手)
引用回帖:
20楼: Originally posted by 小小米呐 at 2013-07-03 20:35:54
请问3C/6C是什么呀，我今天配的Acr和Bis就一直不溶，超声波震荡仪也没效？急急急...

因为浓度比较大，可以适当加一点热，很快就融了，对储备液没有任何影响
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25楼2013-07-04 23:38:36
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苏州生健

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by rhy1027 at 2011-04-18 17:36:47
我跑过Trcine-SDS-PAGE.我的蛋白3.5KD。其实你不一定需要配阴极阳极液，直接配3层梯度胶就可以，running buffer 加大离子强度，然后再冰上跑就没问题了！当然如果钱不是问题的话，更简单，买Invitrogen的4-16%梯度分 ...

请问3层梯度胶怎么配
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28楼2013-11-26 17:00:29
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苏州生健

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-09-24 15:06:46
二楼的方法我也用过，可以很好的分离4kD的小蛋白。其实10kD的蛋白不一定用tricine胶。可以自己做个12-21%的梯度胶，或者胶里加加6M尿素。至于什么阳极阴极缓冲液，你只要把阴极缓冲液加在上槽（和胶的样品孔相连）， ...

请问12%-21%的梯度胶怎么配，还有6M尿素在凝胶中的具体作用是什么？谢谢
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29楼2013-11-26 17:02:45
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softcheese

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
送红花一朵
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16楼: Originally posted by 静静秋 at 2013-05-27 10:10:51
我最近在做Tricine胶，和普通胶的区别在于胶的配置方法不同，还有就是需要用阴阳两极缓冲液。可以先用低电压跑30min，然后再用正常电压跑完，注意控制温度，最好放在4℃的冷冻柜里面跑，效果会更好。
染色液和脱色 ...

请问你说的低电压是在什么时候开始低电压呢，电压大概是多少呀？
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31楼2014-03-16 09:21:51
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丢lai丢qu

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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5楼: Originally posted by rhy1027 at 2011-04-18 17:36:47
我跑过Trcine-SDS-PAGE.我的蛋白3.5KD。其实你不一定需要配阴极阳极液，直接配3层梯度胶就可以，running buffer 加大离子强度，然后再冰上跑就没问题了！当然如果钱不是问题的话，更简单，买Invitrogen的4-16%梯度分 ...

您能帮我看一下我做的这个小分子的电泳跑成这样的原因吗？万分感谢
【求助】急！有木有做过Tricine－SDS－PAGE小分子蛋白电泳的进！
2014.7.29xiao_副本.jpg
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32楼2014-07-31 10:34:15
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123abcd..

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32楼: Originally posted by 丢lai丢qu at 2014-07-31 10:34:15
您能帮我看一下我做的这个小分子的电泳跑成这样的原因吗？万分感谢

2014.7.29xiao_副本.jpg
...

我的也是这个情况，请问解决了吗？
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33楼2016-03-30 19:46:17
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小小米呐27楼
2013-07-05 11:50   回复  
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25楼: Originally posted by 静静秋 at 2013-07-04 23:38:36 因为浓度比较大，可以适当加一点热，很快就融了，对储备液没有任何影响...

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