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zhuyanran

铁虫 (初入文坛)

[求助] 关于tricine-sds-page的一些问题

我在跑小分子多肽电泳时，有几个问题想请大家给指导一下
（1）在浓缩胶和夹层胶条带都是压成一条线的，可是一进分离胶就扩散的很严重
（2）我的样品为什么在loading buffer里溶解后loading buffer和样品分层呢，上样时有白色沉淀
（3）现在marker跑的挺好的，可是样品死活跑不出来，而且分离胶扩散很严重
希望高手指点一二，谢谢啦！
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1楼 2013-11-27 10:03:08
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-11-27 13:29:50
zhuyanran: 金币+5, ★有帮助, 希望多多指导，还有很多要请教的，谢谢了！ 2013-11-27 20:40:55
1. 你指溴酚蓝前沿扩散吗？
2. 怀疑你的样品本身含有一些成分，与SDS发生沉淀。你的样品是怎样提取的，有什么特殊试剂？
3. marker好说嘛胶没有问题。是样品本身的问题。我觉得你样品制备本身可能用了一些不相容的试剂。
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2楼2013-11-27 12:46:34
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zhuyanran

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-27 12:46:34
1. 你指溴酚蓝前沿扩散吗？
2. 怀疑你的样品本身含有一些成分，与SDS发生沉淀。你的样品是怎样提取的，有什么特殊试剂？
3. marker好说嘛胶没有问题。是样品本身的问题。我觉得你样品制备本身可能用了一些不相容的 ...

您好，我用的loading buffer是G-250， 我的样品是微生物的胞外产物，我就用Nacl 离子交换纯化和水过分子筛纯化做的，没有用什么特殊的试剂，我用的loading buffer是参照2006年的tricine- sds-page来做的，配方是12%SDS,6%巯基乙醇，30%甘油，0.05%G-250,150mM Tris-cl， pH 6.8. 不知道这是不是有什么问题。在浓缩胶和夹层胶压缩的特别好，但是一进分离胶就扩散的很严重。
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3楼2013-11-27 14:39:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhuyanran at 2013-11-27 14:39:32
您好，我用的loading buffer是G-250， 我的样品是微生物的胞外产物，我就用Nacl 离子交换纯化和水过分子筛纯化做的，没有用什么特殊的试剂，我用的loading buffer是参照2006年的tricine- sds-page来做的，配方是12 ...

你的loading buffer应该没有什么问题。样品的离子强度大对PAGE的影响很大，比方说含有较高浓度的盐或者磷酸根。如果marker没有问题，只能是样品的事情了。检查一下你的样品最终的buffer成分。
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4楼2013-11-28 00:25:49
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zhuyanran

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-28 00:25:49
你的loading buffer应该没有什么问题。样品的离子强度大对PAGE的影响很大，比方说含有较高浓度的盐或者磷酸根。如果marker没有问题，只能是样品的事情了。检查一下你的样品最终的buffer成分。...

里面就是含有较高的nacl，但是分子量太小和盐分不开，反正是一溶解就有沉淀，而且也跑不出来条带。应该是没有磷酸根的。您有没有什么好的建议来除盐呢？
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5楼2013-11-28 13:51:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhuyanran at 2013-11-28 13:51:52
里面就是含有较高的nacl，但是分子量太小和盐分不开，反正是一溶解就有沉淀，而且也跑不出来条带。应该是没有磷酸根的。您有没有什么好的建议来除盐呢？...

可以过脱盐柱或者透析。
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6楼2013-11-28 17:02:23
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zhuyanran

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-28 17:02:23
可以过脱盐柱或者透析。...

我用100-500的透析袋透析两个小时盐没除掉，但是我的样品已经没有活性了，我用多肽柱分离纯化的，但是没有和盐分开。所以我很郁闷，现在跑不出来条带就很着急，是不是哪个过程我出问题了？
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7楼2013-11-28 21:42:14
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zhuyanran at 2013-11-28 21:42:14
我用100-500的透析袋透析两个小时盐没除掉，但是我的样品已经没有活性了，我用多肽柱分离纯化的，但是没有和盐分开。所以我很郁闷，现在跑不出来条带就很着急，是不是哪个过程我出问题了？...

透析除盐时间长短与透析方式、透析液量的多少有关。你要的酶活是否要结合辅助因子？有可能透析时辅助因子掉了。如果你只是为了跑变性电泳，是否有活性问题不大。如果你要活性样品，可能需要在透析液液中加入辅助因子或者透析完再加入重新结合。
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8楼2013-11-29 01:26:04
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