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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » SDS-PAGE跑谷蛋白无法浓缩，实验图弥撒的问题
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66suyuan

木虫 (正式写手)

[求助] SDS-PAGE跑谷蛋白无法浓缩，实验图弥撒的问题

我在做种子谷蛋白SDS-PAGE的实验。最近几次实验都出现了浓缩胶阶段无法浓缩的问题，一直到分离胶都是弥散很宽。

然后结果就很不好分析，这两张还好点，还有更无法分清楚的，条带只能勉强数，但肯定是不能用的三。

之前一直是恒流20mA（横流后，刚开始电压大概50V）跑的，然后我今天又重新试了下，打算浓缩胶部分电压搞高点看行不，就跑了恒压120V（刚开始电流大概60mA），结果还是弥散，已经到分离胶了还是弥散的。结果肯定也不行

敢问有经验的师兄师姐，能帮忙分析下原因吗？？

实验图

这个是我刚刚拍的照片，已经到到了分离胶的地方了，完全没有浓缩到啊！！！



[ Last edited by 66suyuan on 2011-10-21 at 12:17 ]
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1楼2011-10-21 12:14:04
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小兵pp

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 鼓励交流！ 2011-10-23 14:53:35
看看电泳缓冲液有没有配错，可以显测下pH看看
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2楼2011-10-21 13:08:24
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yitiandeng

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 鼓励交流！ 2011-10-23 14:53:44
个人感觉原因应该是多方面的，
电压适宜度，我以前是恒压跑的
缓冲液pH,及其新鲜度，我以前做发现跑过一次的下次跑反而效果还好些呵呵
上样多少也会影响
另外看看你的胶浓度以及配胶的试剂和水
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3楼2011-10-21 22:03:57
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 鼓励交流！ 2011-10-23 14:53:52
压缩胶的pH很重要，看配方和Tris有没有问题。
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4楼2011-10-21 22:30:41
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匿名

用户注销 (著名写手)
★ ★
adslye(金币+2): 鼓励交流！ 2011-10-23 14:54:01
本帖仅楼主可见
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5楼2011-10-22 00:05:14
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

adslye(BioEPI+1): 2011-10-23 14:53:20
66suyuan(金币+5): 2011-10-24 20:13:16
分离胶我做过6、8、10、12%的，结果压缩程度为12%最好，6%最差，条带很拖。

在很多因素都没法排除的情况下，120伏是不可取的，因为冲得快往往使得本来就差的效果更差。在效果很好的情况下你可以120，但效果本来就差的，就应该更小，比如60，浓缩胶和分离胶都别太快。

胶凝固的因素，可能过硫酸铵失效，配新的。

电泳液的pH值也别搞错了，反正现在还没能找到原因，就每次都用新的，因为旧的可能脏。

跑胶的温度虽然是如果是变性胶就无所谓，但现在效果这么差，不妨降温。缓冲液4度预冷，跑的时候把槽放到装了冰水混合物的盆里。

你的泡泡较多，如果SDS不超过1克每升，那你的缓冲液就该换了。

蛋白质电泳的影响因素太多，很难说的，最好就是什么都换成新的，别去找原因了，可能会浪费时间。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
6楼2011-10-22 06:03:50
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你的实验是最近出现这样的情况，也就是说之前是好的？那就基本是你试剂过期了。而弥散，主要是因为：
1.胶的空间结构过于稀疏（可以理解为胶浓度低），导致的分离塔板数较低，以致分离能力差。
2.电压方面只是给它一个外在的力，在分离能力强的情况下（可以理解为胶浓度高，空间结构好），这个外力可以提高，实现更高更省时的分离。通俗地理解液相其实也是这样。
因此，可以和前面的人建议的，更换溶液，重新来过。应该不会出现这样的情况。
祝顺利！
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7楼2011-10-23 15:16:46
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