24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

雪前

金虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 1063
帖子: 4
在线: 11.8小时
虫号: 2461545
注册: 2013-05-13
性别: MM
专业: 植物学研究的新技术、新方

[求助] 关于SDS-PAGE出现的问题已有2人参与

我跑的是SDS-PAGE电泳，浓缩胶5%，分离胶12.5%跑质膜蛋白，我用的是银染的方法。上一次也是用同样的方法试剂，蛋白质就跑下来了，但是这一次蛋白质样品卡在浓缩胶与分离胶之间下不来，不知道是什么原因，请各位指点一下，谢谢

20140925_175807.jpg

回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

SDS-PAGE电泳可是跑出来的电泳图条带总是歪的，是曲线的，这是为什么？已经有18人回复
关于tricine-sds-page的一些问题已经有7人回复
原核表达后蛋白跑SDS-PAGE细节问题已经有3人回复
SDS-PAGE电泳图像与问题分析已经有7人回复
Tricine SDS PAGE蛋白电泳问题已经有4人回复
SDS-PAGE 电泳时蛋白样品下不去什么原因？已经有7人回复
SDS-PAGE的问题请教，大家帮帮忙啊！求高手啊！已经有14人回复
sds-page跑胶问题已经有8人回复
求助：植物蛋白SDS-PAGE跑胶问题已经有8人回复
Tricine-SDS-PAGE电泳到大约距离底部1/3处出现问题条带扭曲已经有8人回复
SDS-PAGE胶的问题已经有9人回复
SDS-PAGE胶板为什么下端会出现这些情况已经有11人回复
SDS-PAGE跑谷蛋白无法浓缩，实验图弥撒的问题已经有6人回复
关于SDS-PAGE电泳问题已经有12人回复
【转】我在SDS-PAGE中所犯的错误，欢迎补充！已经有33人回复
SDS-PAGE电泳遇到的问题已经有26人回复
SDS-PAGE电泳问题已经有6人回复
【求助/交流】SDS-PAGE电泳问题已经有38人回复
【求助/交流】SDS-PAGE配胶，这是怎么了？~~ 已经有18人回复
【求助/交流】SDS-PAGE缩胶问题已经有11人回复

1楼 2014-09-26 13:07:23

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

zbxky

铁虫 (小有名气)

应助: 6 (幼儿园)
金币: 62.5
红花: 1
帖子: 66
在线: 10.8小时
虫号: 4030422
注册: 2015-08-20

【答案】应助回帖

1.装板

将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠，将两块玻璃立起来使底端接触桌面，用手将两块玻璃夹住放入电泳槽内，然后插入斜插板到适中程度, 即可灌胶。

2. 凝胶的聚合

分离胶和浓缩胶的制备：按下表中溶液的顺序及比例，配置10%的分离胶和4.8%的浓缩胶。
试剂名称 10%的分离胶/mL 4.8%的浓缩胶/mL
Acr/Bis 30%
分离胶缓冲液（pH8.9）
浓缩胶缓冲液（pH6.8）
10%SDS
10%过硫酸铵
水
TEMED 5
3.75
0
0.15
0.1
5
1 1.6
0
1.25
0.1
0.1
4.95
1

按上表各液加入混匀后配制成分离胶后，将凝胶液沿凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓用滴管滴入，小心不要产生气泡。将胶液加到距短玻璃板上沿2cm处为止,约5mL。然后用细滴管或注射器仔细注入少量水,约0.5-1mL。室温放置聚合30-40min。待分离胶聚合后，用滤纸条轻轻吸去分离胶表面的水分，按上表制备浓缩胶。用长滴管小心加到分离胶的上面，插入样品模子(梳子);待浓缩胶聚合后，小心拔出样品模子。

3.蛋白质样品的处理

若标准蛋白质或欲分离的蛋白质样品是固体，称取lmg的样品溶解于lmL 0.5mol/L pH6.8Tris-盐酸缓冲液或蒸馏水中;若样品是液体，要测定蛋白质浓度，按1.0～1.5mg/mL溶液比例，取蛋白质样液与样品处理液等体积混匀。本实验所用样品为15～20mg的标准蛋白样品溶液，放置在0.5mL的离心管中，加入15—20ml的样品处理液。在100℃水浴中处理2min，冷却至室温后备用。吸取未知分子量的蛋白质样品20ml，按照标准蛋白的处理方法进行处理。

4.加样

SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳的加样方法：
用手夹住两块玻璃板,上提斜插板使其松开,然后取下玻璃胶室去掉密封用硅胶框,注意在上述过程中手始终给玻璃胶室一个夹紧力,再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽,插入斜板,将缓冲液加至内槽玻璃凹面以上,外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿3mm处即可,注意避免在电泳槽内出现气泡。

加样时可用加样器斜靠在提手边缘的凹槽内，以准确定位加样位置，或用微量注射器依次在各样品槽内加样，各加10～15ml(含蛋白质10～15mg)，稀溶液可加20～30ml (还要根据胶的厚度灵活掌握)。

5.电泳

加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电流控制在15～20mA，大约15～20min;样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电流升到30～45mA，电泳过程保持电流稳定。当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1～2cm处即停止电泳，约1-2小时。如室温高，打开电泳槽循环水，降低电泳温度。

6.染色、脱色
电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心插入铜丝作为标志，放入大培养皿中染色，使用0.25%的考马斯亮蓝染液，染色2～4h，必要时可过夜。弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经常换脱色液，直至蛋白质带清晰为止。

7.结果处理

1)测量脱色后凝胶板的长度和每个蛋白质样品移动距离(即蛋白质带中心到加样孔的距离)，测量指示染料迁移的距离。
2)按以下公式计算蛋白质样品的相对迁移率(Rm)
相对迁移率=样品迁移距离(cm)/染料迁移距离(cm)
3)标准曲线的制作：以各标准蛋白质相对迁移率为横坐标，蛋白质分子量的对数为纵坐标在半对数坐标纸上做图，得到一条标准曲线。
4)测定蛋白质样品的分子量：根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查得该蛋白质的分子量。英格恩生物