24小时热门版块排行榜

返回列表

渭水凡夫

铁虫 (小有名气)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 131.5
红花: 2
帖子: 70
在线: 35.3小时
虫号: 2100849
注册: 2012-11-01
专业: 生殖生物学

[求助] 求助解读PCR图为什么会这么烂

之前做的都挺不错挺稳定的回了半个月的家之后就做不出来了所有的东西都换新的试了还是不行啊，，，，求大侠指点迷津
体系25ul
buffer 2.5 Dntp 2 F 0.3 R 0.3 模板 0.5 酶 0.5 水补至25ul

求指点迷津

回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

核酸生物学实验经验

细胞培养

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

PCR电泳图求解已经有13人回复
求助~~~~~PCR产物条带分析已经有15人回复
求助：做克隆的时候SOC培养基如果污染的话，后面菌落长出来，做PCR会有什么后果？已经有5人回复
求助：菌落PCR条带弱且拖尾是怎么回事啊？已经有18人回复
新手求助PCR产物Blast问题，先谢谢大家了已经有11人回复
求解释这pcr是啥问题，帮同学问的^_^ 已经有29人回复
急求RT-PCR电泳图分析已经有22人回复
求帮忙分析下菌液PCR检测结果已经有19人回复
求助PCR反应参数设置已经有9人回复
SSR-PCR求助已经有21人回复
求助高手分析DGGE图谱，附PCR图和DGGE图谱已经有6人回复
【求助】我这叫什么PCR呢？已经有5人回复
【求助/交流】如何对PCR测序产物进行分析？已经有11人回复
【求助/交流】PCR出现SMEAR 已经有9人回复
【求助/交流】荧光PCR扩增曲线问题已经有18人回复
【求助/交流】pcr结果电泳条带很淡已经有14人回复
【求助/交流】菌落PCR为什么每次都扩不出来呢？已经有9人回复
【求助】PCR退火温度及时间如何确定已经有10人回复
【求助/交流】帮忙分析下荧光PCR扩增图谱已经有4人回复
【求助/交流】求助junction PCR 原理已经有3人回复
【求助/交流】有没有人像我这样PCR一会做的出来一会又做不出来的已经有16人回复
【求助/交流】求助PCR产物纯化已经有16人回复
【求助/交流】PCR总是做不出来，请帮忙分析下原因已经有12人回复

平静的水和不叫的狗是最可怕的

1楼 2013-09-18 00:01:31

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

回帖置顶 ( 共有1个 )

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

专家经验: +218
MolEPI: 44
应助: 397 (硕士)
贵宾: 0.044
金币: 2118.9
散金: 10
红花: 208
帖子: 5633
在线: 571.6小时
虫号: 1766465
注册: 2012-04-19
性别: MM
专业: 生物大分子结构与功能
管辖: 生物科学综合

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 回帖置顶 2013-09-19 13:47:36
gyesang: 金币+5, 鼓励回帖交流！ 2013-09-19 13:47:42

楼主的PCR扩增应该是出现涂抹带或片状带或地毯样带。

PCR扩增时出现涂抹带或片状带或地毯样带的原因与对策

2013年8月23日总结（第二次修订，加上序号，使文章的层次清晰，另外修正了错漏之处）

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

其对策有：
  1.减少酶量（一般以2单位Taq DNA聚合酶为基点，分梯度上下调一调，其他酶也差不多如此浓度，可以参考说明书）；加强DNA聚合酶的专一性或调换另一来源的专一性更好的DNA聚合酶。
  2. 增加DNA聚合酶的专一性。
（1）改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。
（2）酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油，若此操作引起酶的浓度过高，可以适当加双蒸馏水稀释。
（3）为了加强Taq DNA聚合酶的专一性。的专一性，可在反应体系中加入：1-1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率，两者可以增加Taq DNA聚合酶的稳定性。
3.适当减少dNTP的浓度；减少dNTP的浓度一般需要与降低Mg2+浓度同方向偶联进行，但是不必按同样的比例。
4.适当降低Mg2+浓度，可以采用梯度递减方式，以每次0.5mol/L递减，但是Mg2+的终浓度不要低于1.0mol/L。
5. 缩短PCR反应的退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物之前，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则在引物的Tm少5-10度的范围内把PCR反应的复性温度提高1-3度。
6.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。
7.采用使用专一性更强的梯度降低PCR、热启动PCR和巢式PCR。使用热启动模式。使用热启动时可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。巢式PCR也有现成的试剂盒可以购买。
8. 保证PCR反应的DNA模板的质量，要用电泳检测一下分子量和纯度，质量不好则要重新提取和纯化DNA模板；适当增加DNA模板量，减少循环次数。
9.以上措施都不行时，最后就只能重新设计引物，加强引物的专一性。