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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR扩增效率
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dong_yue

金虫 (小有名气)

[求助] RT-PCR扩增效率

我刚开始做RT-PCR，用的是仪器是7500，荧光燃料法，做标线时扩增效率总是在一百十几。求解决方法。
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1楼 2013-08-25 10:30:38
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-25 16:32:51
可能有非特异扩增或者引物二聚体。你查看熔解曲线了吗？
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2楼2013-08-25 12:54:57
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项羽1990

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
非特异扩增的问题吧，楼上说的有道理
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额
3楼2013-08-25 14:48:42
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dong_yue

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-08-25 12:54:57
可能有非特异扩增或者引物二聚体。你查看熔解曲线了吗？

溶解曲线主峰都在同个位置
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4楼2013-08-25 16:39:56
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qingyuansw20

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dong_yue: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 谢谢 2013-08-25 21:28:19
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-25 22:38:30
1、楼主做的是qRT-PCR。
2、扩增效率过高，通常是引物引起的，引物使得非特异性条带（不是目的基因）大量产生，机器将这些非特异性条带的信号全部接受了，导致扩增效率过大。
3、qRT-PCR扩增效率正常值为95%-105%。
4、解决办法：更换引物，引物的pcr产物片段控制在200bp-300bp（我记得是，你再查查文献）。
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5楼2013-08-25 18:41:45
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-26 10:11:33
引用回帖:
4楼: Originally posted by dong_yue at 2013-08-25 16:39:56
溶解曲线主峰都在同个位置...

如果熔解曲线不是单一峰，说明有非特异扩增或者引物二聚体，这些产物也会发荧光，所以造成每增加一个循环，荧光的增加比两倍要多，计算出来的扩增效率就会大于100%。
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6楼2013-08-25 23:10:01
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词行者

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-08-25 23:10:01
如果熔解曲线不是单一峰，说明有非特异扩增或者引物二聚体，这些产物也会发荧光，所以造成每增加一个循环，荧光的增加比两倍要多，计算出来的扩增效率就会大于100%。...

你傻啊你，人家明明说了在同一位置，同一位置，眼睛瞎啊
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7楼2014-08-22 22:29:04
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wx26794

新虫 (初入文坛)
扩增效率跟阈值线位置有关，一般阈值线过低，计算得到的扩增效率会偏大，建议把阈值线调到log图线性部分的中段
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8楼2015-06-01 17:08:28
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